08-7生化物质的测定方法讲述.ppt

高级生化与生化实验技术 第一部分蛋白质化学 蛋白质化学导论 蛋白质的一级结构 蛋白质的高级结构 蛋白质的结构与功能的关系（蛋白质的性质与功能） 蛋白质的化学修饰 食品蛋白质 第二部分 生化实验技术 生化物质的分析检测方法 生化物质的制备和分离纯化 蛋白质的分子结构与性质研究 免疫学方法在生化实验中的应用 第二部分 生化实验技术PART 2 BIOCHEMICAL EXPERIMENTAL TECHNIQUE 生化物质的分析检测方法 生化物质的制备和分离纯化 蛋白质的分子结构与性质研究 免疫学方法在生化实验中的应用 第七章 生化物质的分析检测方法 滴定分析法 光谱学方法 放射性同位素方法 一些特定生化物质的分析检测 7-1 滴定分析法 适合滴定分析的条件 常用的滴定方法 注意事项 适合滴定分析的条件 反应有严格的化学计量关系 反应能够迅速完成 有合适方法确定滴定终点 常用的滴定方法 酸碱滴定 直接滴定、间接滴定 氧化还原滴定 重铬酸钾法、高锰酸钾法、碘量法 沉淀滴定 配位滴定 注意事项 标准溶液与基准物质 反应条件的控制 反应的适用范围 滴定终点的判断 反应干扰因素的消除 结果的正确计算 7-2光谱学方法 电磁辐射与光谱 光吸收的定量 紫外与可见光光谱法 荧光光度法 红外光谱法 核磁共振法 电磁辐射与光谱 光属于电磁波 自然界中存在各种不同波长的电磁波 分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之间 200nm－400nm为紫外光区 400nm－760nm为可见光区 760nm－10,000nm为红外光区 光吸收的定量 Lambert-Beer’s Law -lgT = A = D = a C L T：transmittance；A：absorbance ；D：optical density a： absorbance coefficient（摩尔吸光系数/百分吸光系数） L：distance/thickness 分光光度计基本结构简介 分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。 无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统 光源 钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。 氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。 红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr为锆，Ｙ为钇）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe为铈）及ＴhＯ2（Ｔh为钍）之混合物制成。 分光系统（单色器）与狭缝 单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。 比色环 比色环也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。 玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。 不能用手指拿比色杯的光学面， 用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。 检测器系统 检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。 紫外与可见光光谱法 定量方法： 吸光系数法、标准曲线法、对照法 注意事项： 选择合适的仪器和比色皿 尽可能在吸光度0.1~1.0的范围内测定 选择合适的灵敏度 尽可能做吸收光谱 做空白与对照实验 荧光光度法 激发光/发射光（荧光fluorescence） 定量方法： 直接测定法：标准曲线法、对照法 间接测定法：化学转化法、荧光瘁灭法、敏化发光法 注意事项： 选择合适的仪器和比色皿 控制好测定的溶剂、浓度、酸度、温度、时间，并尽量消除干扰因素 选择合适的激发波长和发射波长 做空白与对照实验 荧光光度法比紫外可见光度法灵敏1 000~10 000倍 红外光谱法、核磁共振法 主要进行物质结构和成分的分析 分光光度技术的基本应用 测定溶液中物质的含量 用紫外光谱等鉴定化合物 用紫外光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。 方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度──波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。 各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸