病理学技术课题.ppt

IgAN，bFGF的表达， sABC法 IgAN, PDGF的表达， sABC法 免疫组织化学在病理诊断中的应用范围 1.肿瘤诊断： 未分化恶性肿瘤性质判定； 圆形、梭形、多形性肿瘤细胞鉴别； 转移肿瘤的原发部位的确定。 2.淋巴瘤的诊断： 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤； 各种淋巴瘤的分型。 3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素〕 4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤 5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否〕 6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓〕 7.细针穿刺（细胞学诊断〕 8.部分肿瘤来源分类 9.乳腺癌激素受体检测（ER，PR〕 10.肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs) 11.增殖细胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定肿瘤的预后 12.病因诊断（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等〕 免疫组织化学在病理诊断中存在的不足 1.与分子生物学等技术相比，范围有限 2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的 抗体 3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗 体，常常可表达多种肿瘤 4.免疫组织化学标准化问题 三．免疫组织化学的基本技术 （一〕? 取材 1．实验动物：麻醉 （处死〕，锋利刀片切成大小适中， 厚度3mm～4mm; 小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4％多聚甲醛〕 取材 2．人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织 （二）固定：原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1~12h。 1．常用的固定剂： 1）甲醛缓冲液：广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不直超过24h。 2）4％多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。 3）戊二醛~多聚甲醛缓冲液：适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。 4）其它：如PLP液（过碘酸~赖AA~多聚甲醛固定液）、丙酮及醇类、锇酸等。 2．固定注意事项： 1）固定液的选择标准：A. 组织形态结构保存良好；B. 最大限度 保存抗 原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。 2）组织块的大小：1.5cm×1.5cm×0.5cm为宜。 3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成 反比。 4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在4℃ 冰箱。 5〕固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。 （三）包埋：1.石蜡包埋；2.冷冻包埋；3.环氧树脂包理。 （四）切片：1.载玻片的处理： 1）清洗 ；2）涂胶（防止脱片） 常用粘附剂：①明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；②树脂胶： 也称白胶； ③多聚赖氨酸（PLL）；④商品化粘附剂。 2.切片类型： l）石蜡切片：厚约 3～ 5 μm放置 37 ℃温箱烘烤过夜， 以减少脱片。 2）冷冻切片：2 μm。 3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在 载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。 神经组织应用 较多。 四．免疫组化染色过程中的基本技术 （一）蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原抗体最大限度地结合增强特异性染色。 1．常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶 2．消化时间：因组织而异，一般为5~30分钟，消化时间不宜太长，以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。 1）非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。 1．原因分析： 组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等； 试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。 2．消除方法： A. 加 1抗前加正常血清10~30分，以封闭组织中带电荷的基 因，避免与1抗的非特异性结合。 B . 减少非特异性染色： a 免疫酶组化染色时，在加1抗前，用0.3％的H2O2甲醇溶