山东大学生物化学核酸-02汇总.pptVIP

（一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成。 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键对碱敏感。 DNA抗碱水解。 生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 （三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶 1、核酸酶的分类 底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、 核酸内切酶 (endonuclease)。 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 磷酸二酯键的断裂方式： 5’-（寡）核苷酸 3’-（寡）核苷酸 RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶 RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高 RNase T2 产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸 核酸酶S1 作用于单链DNA部分 牛胰核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA 产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸 DNA限制性内切酶 具有非常严格的碱基序列专一性 二、? 核酸的酸碱性质 P504 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。 三、? 核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm 1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） 四、? 核酸的变性、复性及杂交 2、 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82—95℃之间 3、 影响DNA的Tm值的因素 （一）DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。 DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。 （二）RNA的制备 RNase 的灭活： 玻璃器皿：140-200 °C，8小时； 塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37 °C ，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂 （二）PAGE电泳 以聚丙烯酰胺作支持物，这种凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的电泳。聚丙烯酰胺凝胶强度较好，常用垂直板电泳。 (一)、?限制修饰系统 限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。 限制酶的命名，如：E.coRI 第一位：属名E（大写） 第二、三位：种名的头两个字母小写co 第四位： 菌株R 第五位： 从该细菌中分离出来的这一类酶的编号 同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。 BamHI：GG↓ATCC BstI： GG↓ATCC MboI：GAT↓C Sau3A：GAT↓C 同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。 BclI：TG↓AT