基因工程6.基因克隆载体-大容量讲述.ppt

基因克隆载体 生物与食品工程学院 酵母基因克隆载体 酵母： 1. 结构简单的真核生物 2. 培养廉价 3. 可以对外源基因表达蛋白进行加工和修饰 二硫键的正确形成、羰基化 酵母2μm质粒 每个细胞含20~80个拷贝 能在酵母细胞内自我复制 含有复制起始点 ori YEp24载体 构成： 2μm质粒复制起始点的2.2kb片段 酵母染色体基因组URA3 基因(尿嘧啶营养缺陷基因)1.1kb片段 将上述两个片段分别接入pBR322质粒的EcoR I 和 Hind III位点 YEp24载体 YEp24载体 穿梭质粒：人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。 穿梭质粒有利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。 YEp24载体常用于酵母菌高水平表达外源目的基因。 酵母人工染色体载体 构建方法： 端粒、复制起点、着丝粒 筛选标记基因 与质粒结合 酵母人工染色体载体 pYAC4 载体 BamH I、EcoR I双酶切 EcoR I连接外源基因 线性 酵母人工染色体载体的应用 1. 构建基因组文库 装载更大的外源DNA片段 可以包含内含子和调控区 2. 构建染色体的物理图谱 曾被应用于人类基因组计划 酵母人工染色体载体的不足 1. 存在嵌合现象 插入序列可能来自多个片段 2. 稳定性差 继代培养中容易丢失 3. 转化效率低 细菌人工染色体载体BAC 在大肠杆菌F因子的基础上发展而来， 1. 可稳定遗传，缺失、重组、嵌合现象少 2. 转化率高，对宿主毒副作用小 3. 操作容易 4. BAC结构为环状 细菌人工染色体载体BAC 细菌人工染色体载体BAC 将目的基因组建成文库 将文库进行随机断裂制成亚克隆库 利用平台筛选最优序列，即所有这些排列起来能覆盖整个基因组，而且之间要有一定的重叠度，以保证序列搭建无误 将这些分别测序后组装起来 需要预先构建基因组的物理图谱 几种载体容量的比较 普通质粒：一般不超过10kb λ 噬菌体：15kb左右，极限值为23kb 柯斯质粒：31～45kb 酵母人工染色体：一般为500kb，甚至1M BAC：100～350kb Thank You