基因工程原理第9章在酿酒酵母和其他真菌中的克隆讲述.pptVIP

理想的启动子应具有的特性： 1.应受到严格的调控,使生长期与诱导期可以分隔开来。? 2.要有较高的诱导率。? 具有这些性质而且目前使用最广泛的启动子是GAL1基因启动子。 酵母中的半乳糖调控目前研究得最为充分,它们己经成为真核生物转录调控的模式系统。 随着半乳糖的增加，GAL1的mRNA会迅速诱导产生并超过1000倍，可以达到总mRNA的1% * 在酵母中，半乳糖代谢生成葡萄糖糖-6磷酸，其途径与其他生物中相同。 关键酶及对应基因分别是：激酶 GAL1，转移酶 GAL7， 差向异构酶 GAL10，变位酶 GAL5. Melibiose：蜜二糖， GAL5基因是组成型表达的，而其他的所有酶当在半乳糖存在时受到诱导，而在葡萄糖存在时受到抑制。 * GAL4基因编码的蛋白可以结合分解代谢基因的5‘-UAS，从而激活每个基因的转录。 GAL80基因编码一个抑制子，该抑制子与GAL4基因产物直接结合，从而阻止GAL4基因产物激活转录。 GAL3基因产物可以催化半乳糖转化为一种诱导剂，而这种诱导剂可以与GAL80基因产物结合，从而阻止GAL80基因产物去抑制GAL4蛋白与DNA的结合。 * 目前已经开发出来许多不同的专用酵母载体，它们都融入了相应的大肠杆菌载体中发现的有用特性，例如有一个f1起始点就可以对克隆基因的插入产物的纯化融合体进行测序，等等。 上图是一个典型的例子，这些载体有两个方面需要进一步讨论：分泌和表面展示。 * 在酵母中，分配到细胞表面或输出细胞的蛋白在内质网上合成，并转运到内质网内部。 蛋白再从那里运送到高尔基体进行加工，以及包装到分泌泡中。 然后分泌泡与质膜自发融合，或响应外部信号而发生融合。 * 酿酒酵母可以以一种与噬菌体展示系统相似的方式来说明和剖析一个蛋白的功能。 二者都可以用于检测蛋白—配体的相互作用，并筛选出结合能力发生了改变的突变蛋白。但是，噬菌体展示系统往往不能显示出那些那些处于天然功能构象下的分泌型真核蛋白，而酵母表面展示则可以。 * 异源蛋白酵母表面展示。 * 检测蛋白—蛋白的相互作用的方法是利用GAL4蛋白有几个不相连的结构域，分别用于UAS DNA的结合和转录激活的性质发展出来的，称为双杂交系统。双杂交系统已经成为研究蛋白—蛋白之间，以及蛋白—配体的相互作用的主要工具。 * 随着主要基因组测序项目的完成，编码酿酒酵母每个生化活动的基因序列都已经知道了。下一步的任务是把特定生化活动与特定的基联系起来。Martzen等为此发展出了一种快速敏捷的方法，该方法几乎适用于任何生化活动。确定一个特定基因产物的功能通常涉及以下几个方面：确定基因的表达分布，蛋白的亚细胞定位，以及没有该蛋白的缺陷型菌株的表型。通常建立基因的条件性等位基因作为辅助工具。这些过程往往需要多种独立的操作。Ross-Macdonald等发展出一种以转座子为基础的多功能系统，该系统可以同时产生上述所以的分析所需的构造，它也适用于任何给定的酿酒酵母基因的诱变。 * 确定一个特定基因产物的功能通常涉及以下几个方面：确定基因的表达分布、蛋白的亚细胞定位，以及没有该蛋白的缺陷性菌株的表型。通常建立基因的条件性等位基因作为辅助工具。这些过程往往需要多种独立的操作。 * 对酵母基因组进行大规模突变分析还可以采用另外一种方法，即通过PCR来单独删除每个基因的方法。对于每个基因都构建缺失盒，它含有卡那霉素抗性基因、两个分子条形码、以及与上下游序列同源的酵母序列。构建的载体经PCR扩增后转入二倍体酵母菌株，在菌株中缺失盒将替换两个染色体基因序列中的一个。随后，二倍体菌株会产生孢子，可以存活下来的单倍体分离子就是已经恢复的。 * 专用载体 * 用于酵母的特殊载体 * 用于巴斯德毕赤酵母的特殊载体 Yeast surface display Principle: There exists a surface receptor α-agglutinin (凝集素，Aga), which is a glycoprotein consisted of two subunits called Aga1 and Aga2. Aga1is covalently ligated to cell wall and binds to Aga2 by two –S-S-. If a target protein is fused with the C-terminal of Aga2, then the recombinant protein will be displayed on the surface of yeast cells. * * 检测蛋白—蛋白间的相互作用 Principle: GAL4 protein has two sepa