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腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目 录 第一章 简介 1第二章 应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章 主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4? 4.1.1 克隆的一般原则 4? 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5? 4.2.1 共转化的一般原则 5? 4.2.2 共转化方法 5? 4.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6? 4.4.1 细胞铺板 6? 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章 常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8? 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 8? 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8? 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9? 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9? 5.2.2 病毒空斑形成 9? 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10? 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11? 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11? 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12? 5.5.3 Western杂交 13? 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13? 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14? 5.5.6 免疫测定 14? 5.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16? 5.7.1 不连续密度梯度离心 17? 5.7.2 连续密度梯度离心 17? 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18? 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19? 5.8.2 空斑测定法 20? 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章 疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27 缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel E