专题七转基因动物技术及转基因动物总结.ppt

转基因动物技术及转基因动物 转基因动物技术和转基因动物的概念 转基因技术的研究进展 转基因动物技术常用方法 转基因动物的建立方法 转基因动物技术在生物医学研究中的应用 转基因动物的概念 借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并稳定整合在受体染色体上，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体，即转基因动物（transgenic animal）。 转入的目的基因称为转基因（transgene），这种转移目的基因的过程称为转基因作用（transgenesis）。关于“转基因”的概念，通常只限于动、植物中经基因工程技术进行的基因转移，因此品种间不论有性或无性杂交获得新基因的途径都不属此范畴。  转基因动物技术的概念 转基因动物技术是20世纪80年代初发展起来的一项生物技术，它克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。 根据外源基因导入的方法和对象的不同，至今主要有3种途径可以产生转基因动物，即显微注射法、反转录病毒法和胚胎干细胞法。 转基因技术的研究进展 基因分离技术的发展 ：真核生物基因组非常巨大，要从这样庞大的DNA中分离目的基因实非易事。但是由于生物化学、酶学、分子生物学等学科的迅速发展，为基因的分离提供了有效手段，如今已发展了一些新的分离目的基因的技术，如PCR、转座子标签法与基因组消减技术等。  转基因技术的研究进展 基因剔除技术 ：基因剔除（gene knock-out）技术又称基因打靶技术（gene trageting），是20世纪80年代末发展起来的。这是利用同源重组的方法以建立基因定点灭活细胞系或获得基因定点灭活动物。这一技术近年来应用于生物学的诸多研究领域，已获得数百种基因定位缺陷小鼠。  基因剔除技术的原理 首先是用基因重组方法在目的基因片段中插入一外源基因作为筛选标记基因并使目的基因失活（定点突变），再将此（灭活）基因转入胚胎多能干细胞（ES细胞）中，通过细胞内的基因同源重组使灭活基因取代染色体上原有的目的基因。经筛选和基因型鉴定后，把定点突变后的ES细胞注入宿主囊胚腔内，然后将胚胎植入假孕母体子宫，使其发育成目的基因缺陷（突变）的嵌合体，经子代自交后筛选出目的基因缺陷的纯合子即基因剔除动物。  基因剔除的具体实验步骤 首先要进行同源重组载体的设计与构建，即选择具有一定长度（5～7kb以上）与目的基因功能区域同源的序列，并插入选择性标记基因（如新霉素抗性基因neo等），以便于筛选。在此同源序列的一端或两端还可以连接上负筛选标志基因（如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因等）。用电转染等方法将此同源重组载体转染靶细胞。通过药物抗性来筛选重组细胞克隆，并用PCR和Southern杂交等方法对重组细胞进行基因型鉴定，这时得到的就是单个等位基因被剔除的杂合子细胞。为建立等位基因双剔除的细胞系，则还要将单个等位基因剔除的细胞大量传代培养，然后在更高浓度的选择性培养基中多次重复筛选，并对最终得到的阳性克隆进行基因型鉴定。  转基因动物技术常用方法 显微注射技术 反转录病毒技术 胚胎干细胞技术 显微注射技术 优点 外源基因在宿主细胞染色体上的整合率相对较高 以此种方式导入的外源基因可长达50kb 在60—80%的转基因子代鼠中，外源基因分布在所 有的组织和细胞中 不足之处 外源基因的整合是随机的，整合率不能控制 有些动物的原核看不清，需经特殊处理才能有效导入 需要较精密的仪器，费用昂贵 反转录病毒技术 优点 胚胎存活率高 病毒DNA随机单拷贝整合 宿主范围广 不足之处 整合位点是随机的，整合率不高 重组的反转录病毒不够稳定，外源基因易发生重排或丢失 病毒载体的容量不大 病毒DNA序列可能干扰外源基因的表达 胚胎干细胞技术——基本过程 分离培养ES细胞 在ES细胞上作基因操作 获取胚泡期胚胎，作为ES细胞的移植受体 通过显微操作将ES细胞注入胚泡期胚胎的胚泡腔内，与其内细胞团紧靠在一起，成为嵌合体 将注射过的胚泡，经培养后筛选出无发育缺损的囊胚，移植到交配第三天的假孕受体鼠子宫内，发育出转基因动物 胚胎干细胞技术 优点 可用多种方法将外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选 比较方便 可预先在细胞水平上检定外源基因的拷贝数、定位、表达