氨基酸转换反应(一)血液中转氨酶活力的测定技术方案.pptVIP

氨基酸转换反应(一)血液中转氨酶活力的测定 一.目的: 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义,学习转氨酶活力测定的原理和方法。 二.原理: 生物体内广泛存在的氨基转换酶也称转氨酶,能催化α –氨基酸的α –氨基与α –酮基互换,在氨基酸的合成和分解尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活力最强。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多，本试验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α –酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。 丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。 三.器材 1.试管及试管架 2.吸管 3.恒温水浴 4.分光光度计 四.试剂和材料 1.0.1摩尔/升磷酸缓冲液(pH7.4) 250毫升 2.2.0微摩尔/毫升丙酮酸钠标准溶液 40-50毫升 3.谷丙转氨酶底物 150毫升 4.2,4-二硝基苯肼溶液 150毫升 5.0.4当量/升氢氧化钠溶液 1200毫升 6.人血清 五.操作方法 一.标准曲线的绘制:取6支试管,分别标上0,1,2,3,4,5六个号.按下表所列次序添加各试剂. 2,4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙.底物中的α-酮戊二酸与2,4-二硝基苯肼反应,生成α-酮戊二酸苯腙.因此,在制作标准曲线时,须加入一定量的底物(含α-酮戊二酸)来抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响. 先将试管置于370C恒温水浴中保温10分钟以平衡内外温度.向各试管内加入0.5毫升2,4-二硝基苯肼溶液后再保温20分钟,最后,分别向各试管内加入0.4当量/升氢氧化钠溶液5毫升。在室温下静置30分钟,以0号管作空白,测定520毫微米的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。 2.酶活力的测定 取2支试管并标号，用第一号试管作为未知管，第2号试管作为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5毫升，置于370C水浴内10分钟，使馆内外温度平衡。取血清0.1毫升加到第1号试管内，继续保温60分钟。到60分钟时，向两支试管内各加入2,4-二硝基苯肼试剂0.5毫升，然后再向第1，2号管中加入0.4当量/升氢氧化钠溶液5毫升。在室温下静置30分钟后，测定未知管的520nm吸收值。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。（用1微摩尔丙酮酸代表1.0单位酶活力）。计算每100毫升血清中转氨酶的活力单位数。 * * 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 磷酸缓冲液 0.1摩尔/升 pH7.4 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 谷丙转氨酶底物 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 _ 丙酮酸钠标准液 5 4 3 2 1 0 试管号 试剂