蔗糖酶理论讲授__2012.8.13.ppt

凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。 1、影响酶促反应速度的因素 pH值 温度 酶浓度 底物浓度 激活剂 抑制剂 使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。 能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： 在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。 不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。 可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制) 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应Vmax不变。 酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。 5、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验） 1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至30U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0—7编号，0为对照管。 3）按P146页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。 4）取16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。 5）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。 6）按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。 7）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3ml DNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值 7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 “备”则“倍” 有准备、有规划的人生更精彩！ 3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入，距梳齿下缘约1cm，之后加少许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。 ※ 加速剂TEMED要在注胶前加入，否则凝结无法注胶。 ※ 注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。 ※ 水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。 ※ 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶，连续平稳加 入浓缩胶至短玻璃板上缘0.5cm处，迅速插入样梳,静置直到胶凝好。 ※ 样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 实验过程 5. 在上槽内加入电极缓冲液，拔出样梳。 ※ 要使锯齿孔内的气泡全部排出，保证电流通畅。 6.用移液枪距槽底三分之一处加样。加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※ 进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。 ※ 移液枪不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。 ※ 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。 实验过程 7. 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 8. 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入指定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶板和溴酚蓝染料区带中心做好标记。切除浓缩胶并冲洗后放入大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。 9. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不同纯化过程对杂蛋白去除情况。 实验过程 1.正确认识自我，尊重自我——人职和谐的基础 2.充分了解职场，努力做到人职匹配 3.适应社会需求与发展，选择最能发挥自己能力特长的职业。 没有最