耿婷婷-基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立(西北大学硕士学位毕业)教程方案.ppt

五：全文总结 优化磁酶免反应条件 优化化学发光条件 制备免疫磁珠 包被时间的选择 选择抗原包被量 选择磁粒用量 优化封闭反应条件 封闭剂的选择 HPR标记抗原稀释液的选择 优化免疫反应时间 选择抗原包被浓度 选择HPR标记抗原的浓度 选择反应体系 缓冲体系中Tween-20浓度 选择pH值 选择luminol浓度 选择PIP浓度 选择H2O2浓度 方法评价 标准曲线测定 与其他方法灵敏度的比较 法精密度的测定 全文总结 TP抗体的磁酶免化学发光检测法 制备免疫磁珠 方法评价 优化免疫学条件 优化化学发光条件 操作简单 灵敏度高 可自动化操作 致 谢 感谢陈超教授、崔亚丽教授、彭明丽副教授对我学业的悉心指导和辛勤培养。 感谢磁性微粒组全体员工与同学对我无私的帮助。 感谢国微中心全体成员对我工作的支持。 感谢我的父母这么多年在我背后默默的支持与关怀。 感谢各位评委老师。 梅毒在我国再次复燃，据全国性病控制中心统计，首例梅毒病例在1979年重庆市报告后，我国病例数逐年增多，1993年后呈现大幅上升趋势，全国梅毒报告发病率至1998年达4.31/10万，是1993年的25倍，年均增长达90.9%[5]，且神经梅毒和先天梅毒发病率上升[6]。2005年统计结果显示出更为严峻的形势，较2004年增长了28.74% [7]。 * 4. 开发金磁微粒的另一使用方向 * 蛋白分子通过与磁粒表面静电作用、疏水相互作用、半胱氨酸残基侧链的巯基与金的作用等，可一步偶联在金磁微粒表面。对包被前TP抗原溶液及包被反应后剩余溶液的紫外吸收进行检测，结果如图2-3所示： 包被前TP抗原溶液在280 nm处具有明显的特征吸收，包被反应后剩余溶液在280 nm处几乎没有特征吸收，说明TP抗原几乎全部包被在了金磁微粒表面。 * 金磁微粒结合TP抗原反应迅速，20 min左右即可完成偶联反应，为保证反应完全，尽可能提高TP抗体利用率，实验过程中选取包被时间30 min为最佳包被时间。 * 组装型金磁微粒平均粒径5 μm，微粒本身不透光，当悬浮在液体中时呈现深棕色，对光线具有一定的遮蔽，因此选择合适的磁粒用量尤为重要。 各反应中金磁微粒使用量不同，但磁粒表面TP抗原的包被量相同，均为280 ng/孔。由检测结果可知，磁粒为10 μg时化学发光检测阳性信号偏低，这可能由于磁粒量过少导致的清洗损失所致。磁粒为50 μg/孔、100 μg/孔悬浮在反应皿中时，随着磁粒量增加，清洗时少量的磁粒损失对体系整体影响降低，但是由于磁粒浓度增大带来的光线遮蔽现象逐渐明显，总体作用同样导致化学发光检测阳性信号降低。磁粒为30 μg/孔时，磁粒增加导致的信号增强与磁粒过多导致的信号降低达到平衡,，化学发光强度值达到最大，本实验选择30 μg/孔进行后续研究。 * 常用封闭条件为4?C过夜，但实验中发现4?C过夜并不适用于金磁微粒的封闭，达不到理想的封闭效果，阴性值较高，如表2-1所示。这是因为磁性微粒4?C过夜时基本完全沉降在管底，不能充分反应导致。增加37?C震荡2 h，明显加强了封闭效果，阴性值较低。所以本实验之后选择37?C震荡2 h加4?C过夜，进行后续研究。按照1.3.4.1所述步骤，通过对阴性和阳性血清的测定确定封闭的最佳条件结果见表2-1： * 如表所示，1%明胶作为封闭剂时，由于明胶与磁粒有发生了很强的吸附作用，溶液粘稠，无法磁性分离，不能进行后续试验。单纯用10%小牛血清和0.5%的 (BSA)为封闭剂不能完全封闭磁性微粒的位点，阴性值很高。5%脱脂奶粉可以很好的封闭金磁微粒中的活性位点，但阴性值仍然偏高，但继续增加脱脂奶粉浓度至10%时，奶粉已经很难溶化，封闭液十分粘稠，无法进行后续实验。另一方面，小牛血清中由于含有与人血清相似的蛋白成分，可以补充脱脂奶粉的不足，进一步对金磁微粒表面的活性位点进行封闭。所以结合脱脂奶粉与小牛血清，封闭液中含有5%脱脂奶粉与2% 小牛血清，37?C震荡2 h加4?C过夜，得到满意的封闭效果。 * 包被有TP抗原的金磁微粒中加入阴性血清与HRP酶标抗原进行反应时，HRP酶标抗原会非特异性吸附在磁粒及包被抗原表面，经过PBST六次清洗仍然很难去除干净。如有残留，非特异性吸附的HRP酶标抗原会参加后续反应，造成阴性值偏高。在反应体系中加入表面活性剂可降低非特异性吸附，另外高浓度的无关蛋白可以竞争非特异结合位点，亦可降低HRP酶标抗原非特异性吸附。本实验结合表面活性剂Tween-20与小牛血清作为酶标抗原稀释液，得到了良好的阴性信号， 加入0.05%Tween-20可以部分降低阴性信号。另外加入小牛血清竞争非特异吸附位点，随着小牛血清加入量的增加，阴性信号逐渐下降，当到达20%时基本进入平台期。本实验选择PBST+20