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大肠菌群的检测 大肠菌群的定义: 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 实验原理 大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。 实验器材 蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵培养基试管10支 2.9mL蒸馏水试管5支 干热灭菌物体： 10mL移液管1支 1mL移液管5支 实验试剂 乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚指示液25mL 乳糖 10.0g 牛胆盐5.0g 水1000mL 除0.04%溴甲酚指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节PH值为7.2-7.6，加入0.04%溴甲酚指示液，根据要求的用量分装于含倒管的试管中，灭菌。 麦康凯琼脂培养基 大肠菌群及大肠杆菌测定 ——MPN法检验流程 实验内容与步骤 1）检样稀释（无菌操作） ①将25mL（或g）检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用8000－10000r/min的速度处理1 min）制成1：10的均匀稀释液。 ②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。 ③另取1mL灭菌试管，按②操作依次做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1 mL灭菌试管。 2）乳糖发酵实验 接种1mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度，每一稀释度接种3管，置（36土1)℃温箱内培养（24士2) h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3）分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（36士1)℃恒温箱内培养18一24 h。取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 4）证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36士1)℃恒温箱内培养（24士2) h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 查MPN表 实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（或g）大肠菌群的MPN。 革兰氏染色 基本原理： 革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。 步骤： 结果: 阳性菌——紫色 阴性菌——红色 革兰氏染色法（Gram Stain） 革兰氏染色法操作步骤 1、涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。 2、染色：用草酸铵结晶紫染色1min ,用水冲洗。 3、媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。 4、乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。 5、复染：蕃红染液复染1min ,水洗。 6、吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。 细菌经结晶紫初染染成紫色。 革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构