二维凝胶电泳和质谱技术说课.pptVIP

双向凝胶电泳和质谱技术 刘 东 TEL:E-mail: liudong@163.com 全军免疫学研究所 主要内容 双向凝胶电泳的原理 双向凝胶电泳的流程 双向凝胶电泳的局限性和进展 双向凝胶电泳的应用 质谱的定义 离子源（ESI和MADLI） 质量分析器（四级杆，离子阱，TOF,FT-ICR) 质谱图的意义和解析 导 课 蛋白质组研究策略 目前唯一能分离上千种蛋白的技术 1.1.1电泳的基本知识 电泳的定义：带电粒子在直流电场中向着所带电性相反的电极移动的现象。 影响电泳的因素： 1． 带电粒子的带电状态（电量和电性）。 2． 带电粒子的分子量大小和分子形状。 3． 电场强度。 4． 缓冲液的PH 值，组成成分及离子强度。 5． 支持介质的吸附和电渗作用。 1.1.2 蛋白质电泳的基本知识 蛋白质电泳的原理一： 蛋白质是两性电解质：在不同的pH条件下，所带电荷不同。 当蛋白质各种带电离子所带正电荷数与负电荷数相等时,此时溶液的pH就是这种蛋白质的等电点(pI). 不同蛋白质等电点不同，在同一缓冲液中所带电性及电量不同，电泳时迁移的方向和速率不同。  1.2.1 等电聚焦定义 等电聚焦（IEF) ：利用一种特殊的缓冲液（两性电解质）在聚丙烯酰胺凝胶上制造一个pH梯度，电泳时，蛋白迁移到其等电点就不带电荷而停止电泳，通过该方法分离蛋白的方法。 1.2.2固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG） IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。 通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。 1.3.1 二维SDS同普通SDS类似。 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶 1.3.2 SDS的基本原理 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 SDS： 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 作用: 断裂分子内和分子间的氢键 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 SDS. 二维电泳基本操作流程 样品准备 等电聚焦（IEF, 第一维） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS,第二维) 染色 图像分析 质谱分析 数据库分析，鉴定蛋白 2.5 常用检测蛋白的方法 Colorimetric staining(考马斯蓝染色,银染) Blotting Isotopic methods（同位素） Chemiluminescent methods(化学发光） Fluorescent methods（分子荧光） 2.6 凝胶的图像处理分析和典型流程 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 2.7 蛋白点获取 人工切胶 自动切胶仪 2.8 蛋白鉴定 蛋白斑点的酶解（将蛋白切成肽段） 凝胶内酶切 电洗脱后在溶液中酶切 电转移到膜上在膜上酶切 在印迹过程中酶切 质谱分析 MADLI-TOF ESI-MS-MS…... 3. 二维电泳存在问题 低丰度蛋白点的检测 极酸或极碱性蛋白的分离 高分子质量区蛋白的分离 膜蛋白的提取和有效分离 重复性和灵敏度问题 4. 二维电泳研究进展 虚拟二维电泳：IPG＋MADLI－TOF SDS+MS/MS 二维/多维色谱技术 2-DIGE（多荧光） 质谱与蛋白质 对于蛋白质的“鉴定”，较早期的方法是利用Edman 测序，但利用这些技术花費的时间较长； 如Edman测序，一天只能鉴定出1-2个peptides 对于研究蛋白质组学的研究员来說，要用这些传统的方法来解出自然界中成千上万的蛋白质结构，实在是天方夜谭。 高通量鉴定蛋白的方法：质谱 质谱的定义 质谱(MS)技术是利用离子化的帶电物体在磁场或电场中的行为确定其分子量，利用这些质量信息对分子进行鉴定的技术。 ? 离子源 电离： 质谱进行分析时，首先要做的就是离子化，也就是將待测物处理过后产生气相的离子，並带有电荷。 离子源: 使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同,分为硬电离和软电离。 常见的电离方式 硬电离： EI (Electron Impact Ionization):电子轰击电离 CI (Chemical Ionization):化学电离 FD (Field Desorp