实验4微生物对表面活性剂的降解解答.ppt

微生物对表面活性剂的降解 熊金波 * 1.实验目的 了解微生物对有机物的降解； 掌握微生物对有机物降解效率的测定。 * 2. 实验原理 表面活性剂：具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，使表面张力显著下降的物质。 表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效成分，多是直链型烷基苯磺酸盐类（LAS）。 水体： 导致水生细胞膜透性增加，胞内物质外渗，最终引起细胞解体。产生泡沫，阻碍水体和大气间的气体交换，引起水质恶化。 * LAS 的生物降解过程 * ω氧化使烷基链末端的甲基被氧化为羧基; β氧化使羧基被氧化并从末端分解脱落两个碳原子 微生物解能力受菌株类型、表面活性剂浓度及其他理化因素影响 3.实验材料和方法 菌种：气单胞菌D-4（Aeromonas sp . D –4） 考察不同起浓度LAS对微生物降解率的影响 培养基：蛋白胨0.5g ；NH4NO3 0.5g ;KH2PO4 0.1g; K2HPO40.1g; NaCl 0.5g；蒸馏水100ml；pH 6.7~7.2; 灭菌备用。（每组4瓶） 合成洗涤剂：4种浓度的培养液（含LAS：40、120、180、240 mg/L）。培养液分装于500ml三角瓶，每瓶注100ml，不同LAS浓度标记清楚，灭菌备用。 * 3.实验材料和方法 亚甲基蓝溶液： 100mg 亚甲基蓝溶于100ml蒸馏水。取30ml于1000ml 容量瓶中，加6.8ml纯H2SO4 和50g NaH2PO4.2H2O, 定容至1000ml。 LAS标准溶液： 称取LAS 0.5 （99.5％LAS标准品）溶于500ml 蒸馏水，浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml，则LAS浓度为0.01mg/ml = 10mg/L。 洗涤液 ： 取6.8ml分析纯浓H2SO4及50gNaH2PO4.2H2O溶于蒸馏水并稀释至1000ml * 4.实验方法 接种：气单胞菌D-4斜面菌种1支，10ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。 每瓶培养液中接入菌液1ml，每种LAS浓度接1瓶，另设1瓶不接种作负对照。 培养: 32℃，振荡200r/min培养48h。离心除去菌体（8000 r/min离10min），上清液留作测定LAS用。 * 4.实验方法 LAS测定 绘制标准曲线： 取0ml、2ml、5ml、10ml、15ml、20ml LAS 标准液（0.01mg/ml）稀释至100ml制成不同浓度标准液。标准液100ml装于250ml分液漏斗中，用H2SO4调节pH值至微酸性，加亚甲基蓝液25ml。 1.向上述分液漏斗中加氯仿10ml，猛烈振荡30s，静置分层，将氯仿层排入另一个250ml分液漏斗，如此提取二次。(萃取剩余LAS） 2.洗涤：在上述提取液中加入50ml洗涤液，剧烈振荡30s，静置分层，将分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至一个50ml容量瓶中。 3.再次提取：加氯仿6ml于步骤②的水液中，振荡分层后将氯仿层并入上述步骤②容量瓶中。如此提取二次，然后用氯仿稀释至50ml刻度处。 4.测定LAS：用纯氯仿做空白对照，波长为652nm，测定各标准液的光密度值（OD）。以光密度值做纵坐标，LAS的毫克数（LAS原标准溶液浓度0.1mg/mlⅹ所取该液的毫升数）做横坐标，绘制标准曲线，并通过图解法求出标准曲线的斜率K。 * 标准曲线示意图 * 培养液测定 取离心后的培养液上清1~10ml，于250ml分液漏斗中，用蒸馏水稀释至100ml。 同绘制标准曲线步骤，测得样品的氯仿提取液的光密度值。 按下式计算样品中LAS浓度 * LAS降解度计算 * D为降解度，％；C0为振荡培养开始时的起始LAS浓度，mg/L；Ct为振荡培养若干小时后的残留LAS浓度，mg/L。 修正：如果未接菌液的空白对照经培养后，LAS也有所减少，其差值为C’(mg/L)，则 5. 实验报告 1 . 绘出对LAS的曲线。 2. 计算微生物对LAS的降解速率并阐述在降解过程中应注意的事项。 3. 分析不同的浓度LAS对微生物的降解速率的影响。 * 光合细菌的富集培养 熊金波 * 光合细菌的富集培养 1.采样：选取有机污染严重的水塘或有机质丰富的园地做为采样地点。 2.样品的富集： a 无菌操作分别取泥样1g或水样1mL于厌氧管中（厌氧管已灭菌）； b 加液体培养基至满，拧上螺口帽，造成厌氧环境； c 在温度为30℃，光强为3000～5000lux下培养箱中培养1－2周。 * 示意图 * First. 1 g 土壤或1 ml污水