丙种球蛋白的制备技术方案.pptVIP

丙种球蛋白概念 中文简称：“丙球” 英文名称：γ-globulin、gamma globulin 别名： 免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙 种球蛋白，丙种球蛋白，静脉注射用人免疫球蛋白 （pH4） 丙种球蛋白预防传染性肝炎，预防麻疹等病毒性疾 病感染，治疗先天性丙种球蛋白缺乏症 ，与抗生素 合并使用，可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病 感染的疗效。 注：由于人血中的免疫球蛋白大多数为丙种球蛋白 （γ-球蛋白），有时丙种球蛋白也被混称为“免疫球 蛋白”(immunoglobulin) 。 （2）药理作用 注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把 免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从 低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由 于抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死 细菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、 病毒性感染有一定的作用。 （3）适应症 丙种球蛋白是血液中一种蛋白质，它通常来源于许多人献的 血液，常被用来防止和治疗感染，对慢性疲劳症有显著的改善 作用。适用于预防传染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治 疗先生性丙种球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病毒 性疾病感染的疗效。 制备丙种球蛋白的方法 丙种球蛋白的两种分离制备的方法 ①层析法（如：SephadexG-50） 定义:是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理 以获得分离的方法。 ②电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳) 定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离 子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动， 而达到分离目的的分析方法。 SEPHADEXG-50 Sephadex是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形 成的三维网状凝胶颗粒。 Sephadex凝胶按交联度不同，用Sephadex G 加一个数字来区别型号,数字越小,表示介质交 联度, 分级范围越小，反之亦然。 电泳 作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯 酰胺凝胶（SDS）；非变性聚丙烯酰胺凝胶， 在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依 据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带 的电荷量而逐渐呈梯度分开。 垂直平板： 1多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致－－便于利用各 种鉴定方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠 2可以进行双向电泳 3电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶 圆盘电泳： 1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别， 即使同一样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也 会不同 2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标 记的样品测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适pH， 凝胶浓度；双向电泳中第一相的分离。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用； 样品用量少，灵敏度可达10-6g; 凝胶孔径可调节； 分辨率高。 凝胶系统的分类 1、连续性凝胶电泳 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同， 带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度 及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不 仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。 2、不连续凝胶电泳 垂直电泳原理 阴极电泳用水溶性树脂是一种阳离子型化合物，用 有机酸中和，在水中溶解后，以分子和离子平衡状 态存在于直流电场中，两极产生电位差，离子发生 定向移动，阳离子向阴极移动，并在阴极表面上得 到电子沉积于阴极表面，而阴离子向阳极移动，在 阳极上放出电子氧化成酸。这就是电泳涂装的基本 原理。它是一个非常复杂的电化学反应，其中包括： 电解、电泳、电沉积、电渗四个同时进行的过程。 实验步骤 （1）溶液的配制 a) a贮液为49.5%T,3%C b) b贮液为49.5%T,6%C。 c) 胶缓冲液为3molTris d) 0.3g/LSDS用HCl调pH值至8145 e) 阳极缓冲液为0.2molTris f) 用HCl调pH值至8.9。 g) 阴极缓冲液为0.1molTris h) 0.1molTricine i) 0.13g/LSDS用HCl 调pH值至8125。 j) 样品缓冲液为3molTris(pH8.45) k) 0.8gSDS l) 0.3molDTT m) 少许溴酚蓝,定容至10ml。 n) 胶的制备:按文献分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶,依次 灌胶。 (2)样品处理 去除血清白蛋白后的样品与2倍体积 U9缓冲液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT) 混匀,400～600r/min冰浴振荡30m