核酸的理化性质和最常用分析研究方法.docVIP

【检验常识】核酸的理化性质与最常用的研究方法 江西检验医学网 检验与临床知识 发布日期：[2006/08/31]???? 核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。 一、一般物理性质 1. 溶解度 DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。 2. 分子大小 DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。核酸分子的大小可用长度、核苷酸对（或碱基对）数目、沉降系数（S）和分子量等来表示。 3. 形状及粘度 核酸（特别是线形DNA）分子极为细长，其直径与长度之比可达1：107，因此核酸溶液的粘度很大，即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。核酸若发生变性或降解，其溶液的粘度降低。 二、核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值（图3-25），其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD值相当于50μg／mL双螺旋DNA，或40μg／mL单螺旋DNA（或RNA），或20μg／mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经啡啶溴红染色而粗略地估计其含量。 三、核酸的沉降特性 溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。不同构象的核酸（线形，开环，超螺旋结构）、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中，沉降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。 应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。RNA分离常用蔗糖梯度。分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。氯化铯在水中有很大的溶解度。可以制成浓度很高（8mol／L）的溶液。 应用啡啶溴红—氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。如果应用垂直转头，当转速为65 000r/min（Beckman L-70超离心机），只要6h即可以完成分离工作。但是如果采用角转头，转速为45 000r/min时，则需36h。离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图3-26）。蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提1~2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。这样得到的DNA有很高的纯度， ? 可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。 四、核酸的两性解离及凝胶电泳 核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。但磷酸的酸性较强，在核酸中除末端磷酸基团外，所有形成磷酸二酯键的磷酸基