2017四川农业大学生物化学考研854核酸化学研讨.pptVIP

核酸的变性与增色效应 变性（加热） 复性（缓慢冷却） DNA的变性：在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增色效应）,DNA的功能丧失。 核酸的复性 变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，伴有A260减小(减色效应)，其物理性质和生物活性随之恢复，这一过程称为DNA的复性. 对于热变性的DNA，在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构，称为退火。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复. DNA的复性图示 DNA的复性条件 1.将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。即淬火。 2.将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。退火温度＝Tm－25℃ 3.分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性需要一定的盐浓度，也与它本身的组成和结构有关。 高于Tm值5℃ 复性 也称退火 缓 慢 冷 却 迅 速 冷 却 影响复性的因素 ① 样品的性质(均一性） ② DNA的浓度 ③ DNA片段的大小 ④ 温度 ⑤ 离子强度 核酸的分子杂交 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。制备特定的探针(probe)通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。 Southern Blot：DNA-DNA杂交 Northern Blot：DNA-RNA杂交 Western Blot：抗原-抗体进行杂交 原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光 DNA芯片技术 分子杂交的原理示意图 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 沉降特性 蔗糖密度梯度超速离心是制备RNA的常用方法之一，利用物质在不同梯度溶液中的沉降速度差别进行分离，属于区带超速离心法。 氯化铯密度梯度离心是分别DNA常用的方法，它在离心场中可自行调节形成浓度梯度，并能保持稳定。此法称为等密度梯度离心。 沉降系数（S） 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。? 沉降系数（S）与分子量（M）的关系 M = RTS D(1-??) Svederg方程: 核酸的提取 核酸提取原则：低温、无菌 DNA提取主要步骤：取材 破碎 加入去污剂（SDS/CTAB） 苯酚和氯仿 调节盐溶液浓度去RNA 乙醇沉淀 检测(紫外,电泳) RNA提取：主要破坏和抑制RNA酶活性（焦碳酸二乙酯） 1.核酸分子对紫外光有强烈吸收是因为嘌呤碱基和嘧啶碱基均有 。 共轭双键 2.不同来源的DNA单链，在一定条件下进行分子杂交是由于它们有共同的碱基组成。 错误 3.核酸鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）。 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 DNA回文序列及几种结构形式 回文序列 发夹式结构 十字形结构 中心区域 DNA三链间的碱基配对 DNA分子内的三链结构 多聚嘌呤 多聚嘧啶 DNA分子间的三链结构 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 DNA的三级结构 在细胞内，由于DNA分子与其它分子（主要是蛋白质）的相互作用，使DNA双螺旋进一步扭曲形成的高级结构. 实例：超螺旋 核蛋白体（ 染色体chromosome） DNA超螺旋结构的形成 核小体盘绕及染色质示意图 组蛋白与DNA的结合 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 DNA （2nm） 核小体链（ 11nm，每个核小体200bp） 纤丝（ 30nm，每圈6个核小体） 突环（ 150nm，每个突环大约75000bp） 玫瑰花结（ 300nm ，6个突环） 螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花） 染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花