第五章分子生物学法(上)3介绍.pptVIP

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术;扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。;5.4 SNP的理论与应用;5.4.1 SNP概述;;5.4.2 SNPs经典检测方法;PCR-RFLP方法;PCR-RFLP原理图;单链构象多态性(SSCP);变性梯度凝胶电泳（DGGE）;;等位基因特异 PCR ( AS-PCR);;5.4.3 SNPs高通量的检测方法;DNA测序法;基因芯片技术( Genechips);MALDI-TOF;变性高效液相色谱( DHPLC); SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting）;High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：;;;5.4.4 SNP的应用;Gene SNP by bioinformatics;真核生物基因组庞大，含有大量重复序列。无论是电泳分离技术还是通过杂交的方法，都难以直接分离到目的基因片段。 尽管高等生物一般具有3-5万种左右不同的基因，在单个细胞或组织的特定时间段中，仅有15-20%左右的基因得以表达。;cDNA克隆的基本过程是通过一系列酶催作用，使总poly（A）mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主菌株细胞，构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。;基因工程基本步骤?目的DNA 制备；载体DNA选择↓DNA体外重组技术 ↓ （ DNA酶切实验、 连接实验）重组DNA的转化（转染）试验↓; 重组克隆的筛选与鉴定（重组体的表型筛选，指纹图谱法， PCR方法，探针杂交法 ） ↓ 目的基因表达产物的筛选与鉴定（遗传互补法，免疫化学法－Western印杂交法，微细胞法(microcell method);基因工程流程示意图;5.5.1 RACE(cDNA末端快速扩增);5’RACE 1.在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成 2.RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。 3.用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP 4.以连有oligo(dG)的锚定引 物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。;3’RACE 1.在反转录酶的作用下，以连 有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 2.用RNaseH降解模板mRNA。 3.用通用锚定引物和基因片段 内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。;5.5.2 应用cDNA差示分析法克隆基因;RDA流程图。;;;Topo TA载体;Invitrogen Proprietary Confidential;MultiSite Gateway? - Extending the applications;Gateway大规模克隆技术;Gateway 克隆技术主要包括： TOPO反应和LR反应 TOPO反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体； LR反应：被用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体。;Entry载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别，切开后通过274位酪氨酸与切口处的磷酸基团形成共价键，加入PCR产物后，形成的3’突出端GTGG,攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火，切去GTGG后使PCR产物以正确方向连入Entry载体;;;5.5.4基因的图位克隆（Map-based cloning）;通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来???;图5-25染色体步移法克隆基因示意图;;5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术;5.6.1双向电泳技术 5.6.2蛋白质印迹法 5.6.3蛋白质的质谱分析技术 ;5.6.1双向电泳技术; 当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH