荧光光谱法121220答案.ppt

荧光分析法;2008年诺贝尔化学奖 ; 某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物 ?? 萤石(fluospar)而得名。 我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光。 除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧光等。;;用荧光抗体染色之原生动物;K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306; 某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。;光学光谱区;分子荧光分析的特点：;;分子吸收辐射后; 小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；;S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小； ;S2;激发态→基态的能量传递途径;辐射和非辐射能量传递过程;系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。 禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1?T1 就可发生系间跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s ;2. 荧光的激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum; 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长 ?ex;;激发光谱与发射光谱的关系;c. 镜像规则 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。; 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；;二、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure;2.有机化合物的分子结构与荧光的关系;;三、影响荧光强度的因素 relation between fluorescence and molecular structure;2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降低10℃，? f增加3％，在?80℃时， ? f为1。; 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系： 苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于?NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和pH＞13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。 ;4.内滤光作用和自吸现象;5.荧光熄灭剂;6、散射光; 选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰;四、荧光试剂; 能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：;? ;2．邻苯二甲醛(OPA) 在2?巯基乙醇存在下，pH9～10的缓冲溶液中OPA能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a?氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA 500mg溶于10ml乙醇中，加200ml 2?巯基乙醇，将此混合液加至1L 3％的硼酸溶液中，再用KOH调节至pH10，即为常用试剂溶液。荧光条件为：λex=340nm，λem=