实验室常用实验方法研讨.docVIP

PAGE  PAGE 66 总RNA的提取（Trizol法提取） 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞； 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟； 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清； 让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 RT合成cDNA 使RNA展开与OligoDT结合，25ul体系用2ug的RNA，整个溶液体积小于15ul RNase-free H2O(DEPC水)9.5ulOligo DT1ulRNA 溶解液2ul 浓度过高则减少RNA溶解液的量，但要求RNA溶解液的量+RNase-Free H2O(DEPC水)的量为12.5ul70℃,10min让RNA充分展开；立即至于冰上0℃,5min 10min 让Oligo DT 与其充分结合。不能超过15ul。（此时间正好用于配下个体系液体） 继续在PCR管中加入 5×buffer5uldNTP5ulRnasin0.625ul(0.5ul)MMLV-RT1ulRNase-Free H2Oo.875ul(1ul)总共是25ul 37℃，60min 延伸 94℃，10min 灭活逆转录酶，即合成cDNA PCR 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。 按下列组成在PCR反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方 ReagentQuantity, for 50μl of reaction mixture10X PCR buffer （Mg2+ free）5 μlMgCl2（25mM）如TaKaRa TaqTM加3 μl 如TaKaRa EXTaqTM加4 μl2.5mM dNTP mix4 μl 10μM Primer 上游1 μl10μM Primer下游1 μlTemplate DNA1 μlTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 μlSterile deionized waterUp to 50μlTotal50 μl /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方 ReagentQuantity, for 50μl of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5μl2.5mM dNTP mix4μl 10μM Primer上游1μl10μM Primer 下游1μlTemplate DNA1μlPyrobestTM DNA Polymerase0.25μlSterile deionized waterUp to 50μlTotal50μl /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl以节约试剂； 将上