第八章蛋白质和氨基酸的测定研讨.ppt

第八章 蛋白质及氨基酸的测定;第一节 概述;4、蛋白质分析的重要性;5、蛋白质的测定方法;第二节 蛋白质的定性测定;蛋白质的测定方法;一、凯氏定氮法（常量）;原理;样品制备 消化 中和、蒸馏 滴定 计算 利用换算系数可以把氮的百分含量转化成样品粗蛋白质含量。由于大部分蛋白质含有16%的氮，所以其换算系数一般为6.25（100/16 = 6.25）。 即： %N × 6.25 = %蛋白质; ;在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列物质;硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。;（2） （催化剂、指示剂）硫酸铜;装置;操作步骤;蒸馏;滴定;计算;当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3ml后再继续消化。 一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 蒸馏装置不能漏气。 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。;;二、自动凯氏定氮法;方法特点及应用范围;三、微量凯氏定氮法;蛋白质的快速测定－双缩脲法;方法特点及应用范围;步骤;样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋白质含量在40～110mg之间）于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而由此求得蛋白质含量。;优点：;缺点：;三、福林酚（Lowry）法;优点;缺点;? 四、紫外吸收法;适用范围;优点;缺点;Bicinchoninic Acid(BCA)法;Bicinchoninic Acid(BCA)法;Bicinchoninic Acid(BCA)法;Bicinchoninic Acid(BCA)法;阴离子染色法;蛋白质 + 过量染色剂 蛋白质-染色剂复合不溶物 + 未结合可溶性染色剂 阴离子磺酸基染色剂，包括酸性十二号橙，橙G和酰黑10B，都可以和基本氨基酸残基中的阳性基团（组氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和赖氨酸中的ε-氨基等），以及蛋白质中游离的氨基酸终端基团结合. 未结合的染色剂与样品中蛋白质的含量成反比,可用分光光度计法测定。;方法;应用;优点;缺点;考马斯亮兰染料比色法;方法;应用;优点;缺点;比浊法;比浊法;比浊法;杜马斯法（燃烧法）;杜马斯法（燃烧法）;杜马斯法（燃烧法）;红外光谱法;红外光谱法;氨基酸的测定方法;一、茚三酮比色法;应用;二、甲醛滴定法;方法特点及应用;操作方法;同时取80ml蒸馏水置于另一200ml洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至PH8.2，（此时不计碱消耗量），再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。;结果计算;说明及注意事项;氨基酸的分离及测定;薄层色谱法;氨基酸自动分析仪法;氨基酸分析仪有两种，一种是低速型，使用300～400目的离子交换树脂；另一种是高速型，使用直径4～6um的树脂。不论哪一种，在分析组成蛋白质的各种氨基酸时，都用柠檬酸缓冲液；完全分离和定量40～46种游离氨基酸时，则使用柠檬酸锂缓冲液。但分析后者时，由于所用缓冲液种类多，柱温也要变为三个梯度，因此一般不能用低速型。;气相色谱法;液相色谱法;方法的比较;1．样品的比较：;2．原理：;3．灵敏性：;4．速度：;特殊的注意事项;特殊的注意事项;特殊的注意事项;总结;第三节 蛋白质的定量测定;一、 凯氏定氮法;整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定;;② 蒸馏;影响氨化完全和速度的因素;1用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿） 指示剂 红色 绿色 红色 （酸） （碱） （酸）; 现测定某一种食品的蛋白质的含量， 这种样品含有大量的脂肪，样品经过处理 后加入浓硫酸，为了使浓硫酸与样品充分 结合，经振摇后大火加热进行消化；消化 2h后，估计消化完全，取出消化液加入少 量NaOH进行蒸馏，硼酸（加入了指示剂甲 基红-溴甲基酚绿