第3章细胞生物学方法技巧.ppt

第3章 细胞生物学研究方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;光学显微镜(light microscope);普通复式光学显微镜;显微镜最重要的性能参数是分辨率，不是放大倍数 分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离;普通光镜观察的生物组织样品需要固定、包埋、切片、染色等;相差显微镜和微分干涉显微镜;相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上，添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差;微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别;荧光显微镜;荧光显微镜采用的光源、激发滤片、双分镜等与普通光学显微镜不同(或没有);荧光显微镜样品制备技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 样品可以是荧光染料标记，也可以用可产生荧光的绿色荧光蛋白(GFP)的基因与编码某种蛋白质的基因相融合 ;激光扫描共焦显微镜;通过调节焦平面可获得一系列不同切面上的细胞图像，重构样品三维结构;透射电子显微镜 ;由于细胞厚度及细胞各部分对电子的通透差异不大，透射电镜细胞样品需要超薄切片以及重金属盐染色;超薄切片技术;应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构;负染色技术;冷冻蚀刻技术;电镜三维重构与低温电镜技术;低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160 ℃低温下利用相位衬度成像 研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术;扫描电镜技术;为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2 临界点干燥法对样品进行干燥处理 样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号;第二节 细胞及其组分的分析方法;超离心技术分离细胞组分;密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带;细胞成分的细胞化学显示方法;细胞内特异蛋白抗原的定位与定性;免疫荧光技术;免疫电镜技术;细胞内特异核酸的定位与定性;光镜水平的原位杂交技术 (同位素标记或荧光素标记的探针) 电镜水平的原位杂交技术 (生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合);流式细胞术(flow cytometry);第三节 细胞培养与细胞工程;动物细胞培养;植物细胞培养;原生质体培养: 体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株;细胞工程;单克隆抗体技术：通过HAT 选择培养获得分泌单抗的杂交瘤细胞株;显微操作技术与动物的克隆;转基因(GFP)鸡、猪;第四节 细胞及生物大分子 ?的动态变化;荧光漂白恢复技术;放射自显影技术;对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪的标记方法：持续标记、脉冲标记;第五节 模式生物与功能 ?基因组的研究;大肠杆菌;酵母;线虫(Caenorhabditis elegans);果蝇(Drosophila melanogaster);斑马鱼(Danio rerio);小鼠(Mus musculus);拟南芥(Arabidopsis thaliana);突变体制备技术;在DNA 水平: 基因敲除(knock out) 基因敲除技术在小鼠中的建立与应用为动物功能基因学和人类疾病小鼠模型作出了重要贡献;蛋白质组学(proteomics)技术;Thanks for yourattention!