第2章1生化实验中的缓冲液技巧.ppt

生化实验中的缓冲液;为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。;适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：;⑨ 易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。;（一）磷酸盐缓冲液;用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为： ①容易配制成各种浓度的缓冲液； ②适用的pH范围宽； ③pH受温度的影响小； ④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。;其缺点为： ①易与常见的钙Ca2+离子、镁Mg2+离子以及重金属离子缔合生成沉淀； ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 应用： 1、PB缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4; 2、PBS缓冲液：Na2HPO4-KH2PO4 , NaCl+KCl ;(二) Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris (hydroxymethyl) aminomethane）缓冲液 　 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。;配制常用的缓冲液的方法有两种： ①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；;Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液； ②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。;②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃; ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封; ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。;（三） 有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。 甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa1＝3.10，pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。;有机酸缓冲液的缺点是： ①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用； ②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn2+、Mg2+等）结合而使缓冲液受到干扰； ③这类缓冲液易与Ca2+离子结合，所以样品中有Ca2+离子时，不能用这类缓冲液。;（四）硼酸盐缓冲液 常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 （五）氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：; 甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0， 甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，　 　 　 　 甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液）， 组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5， 甘氨酰胺缓冲液：pH=7.8～8.8， 甘氨酰甘氨酸缓冲液：pH=8.0～9.0。;此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。 其缺点是： ①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。 ②试剂的价格较高。;（六）两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液 1960年，N.E.Good和他的同事们总结了