丙种球蛋白的制备(电泳)详解.pptVIP

项目三 丙种球蛋白的制备;丙种球蛋白类药物;丙种球蛋白;;制备丙种球蛋白的方法;（3）适应症;sephadexG-50;电泳; 垂直平板：1、多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致－－便于利用各种鉴定方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠 2、可以进行双向电泳3、电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶圆盘电泳：1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别，即使同一样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也会不同2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标记的样品测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适pH，凝胶浓度；双向电泳中第一相的分离。;聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：;凝胶系统的分类;垂直电泳原理;实验步骤;(2)样品处理 去除血清白蛋白后的样品与2倍体积U9缓冲液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)混匀,400～600r/min冰浴振荡30min变性。取变性后样品与样品缓冲液等体积混匀,60℃水浴加热5min。;(3)电泳 内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压电泳,先40V约1.5h,当样品进入分离胶时,电压升至60V约1.5h。 (4)染色和脱色 电泳结束时,用双蒸水把胶面洗净。置于染色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯亮蓝G250)中,50～60r/min,振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面,转至双蒸水脱色,1h。更换双蒸水2~3ci直到背景清晰。 ;盘状电泳;图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.9 (2)浓缩胶pH6.9 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3;聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应;分离胶的制备;材料与试剂;五、操作步骤 1、分离胶的制备： （1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端（同学们应该挑选一下比较平的那头），用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。 （3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。;2、浓缩胶的制备： （1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5 cm高。 （2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕。;3、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。;5、接通电源： 接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接负极，下槽电极接正极，稳压300V电泳开始时，电流应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每管3.0-5.0 mA 电流，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约0.5 cm处，（大约需时2小时），停止电泳。确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。;6、练习取出玻管内的凝胶： 将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一边开始??水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。;7、取出玻管内的凝胶 8、凝胶染色： 将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然后加入适量染色液，于摇床上进行振摇染色30分钟，完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。;10、绘图： 最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图，以确定被分析样品的组分。另一种方法是通过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移率，可参考教课书）。 ;注意事项 ;友情提示: 分 离 胶: 7.0 CM 浓 缩 胶: