生物物理课-8.pptVIP

俺怎么越看越象;8.膜蛋白的结构研究;膜蛋白的结构研究;膜蛋白的结构研究;蛋白的膜拓扑学(membrane protein topology);蛋白的膜拓扑学研究;膜蛋白拓扑取向的基本原理;膜蛋白拓扑取向的基本原理;根据35个细菌内膜蛋白的统计结果，胞质腔蛋白loop区与周质腔蛋白loop区中正电荷氨基酸(Lys和Arg)所占比例的比较(A)；以及胞质腔蛋白loop长度与周质腔蛋白loop长度的分布(B)。其中，黑色表示蛋白胞质区片断(cytoplasmic loop)而白色表示蛋白周质腔片断(periplasmic loop)，横坐标为loop长度。 ;蛋白的膜拓扑学研究;蛋白膜拓扑学研究常用方法;蛋白膜拓扑学研究常用方法;关于疏水作用 K.Kauzmann (1959)研究非极性残基从非极性溶剂转移至水中的热力学性质. 模型系统：非极性分子 甲烷(CH4) 非极性溶剂 苯或CCl4 问题的提出：X mole 甲烷从CCl4中移至水中free energy 如何变化？ 由dG = dH – TdS 转移过程：dH (enthalpy) 0 放热导致 dG降低 dS (entropy) 0 熵降低导致dG增加 由于dS对dG的贡献达到80%,故甲烷从CCl4中移至水中free energy 的增加主要来自熵的贡献。 疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！ dS 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！ ;蛋白质嗜水性分析 当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时，溶质从疏水性溶剂转移到水相中化学势变化?Gt可以求知，这个参数常被用来来描述溶质的嗜水性。;可用氨基酸残基从疏水性溶剂转移到水相的转移自由能?G来描述该侧链的嗜水性。 根据热力学公式，溶质在水中的化学势?h为： ?h=uh0+RTlnxh+RTlnfh 其中，xh是以溶质的摩尔分数为单位，?h0为此时溶质在水中的标准化学势，fh为活度系数。 在疏水性溶剂中，类似有： ?nh=unh0+RTlnxnh+RTlnfnh 其中，xnh, unh0 和fnh分别是在疏水性溶剂中溶质的摩尔分数，标准化学势和活度系数。 现定义溶质从疏水性溶剂转移到水相中的转移自由能?Gt为无限稀释溶液中同样溶质的摩尔分数从疏水性溶剂转移到水相中化学势的变化，则?Gt为 ?Gt= uh0- unh0 又当同一溶质在各种溶剂中饱和溶解时，化学势皆相等，故： uh0+RTlnNh+RTlnfh= unh0+RTlnNnh+RTlnfnh 其中，Nnh、Nh分别为溶质在疏水性溶剂和水中的饱和溶解度，所以： ?Gt=RTln（Nnh/Nh）+RTln（fnh/fh） 忽略溶质分子之间的相互作用，则有： ?Gt=RTln（Nnh/Nh） 由此可以得出结论，当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时，溶质从疏水性溶剂转移到水相中化学势变化?Gt可以求知，这个参数常被用来来描述溶质的嗜水性。 ;蛋白质嗜水性分析 蛋白质疏水性分析图的作法： 有了每个氨基酸残基侧链的嗜水性值，通过计算机可以作出一个蛋白质的疏水性分析图。 需要注意的是，蛋白质疏水性分析图中每个氨基酸对应的嗜水性值并非该独立氨基酸侧链的嗜水性值，而是以该氨基酸为中心的一小段肽链嗜水性值的平均，这是因为在蛋白质中，某点的疏水性情况显然要受到周围残基侧链的影响，一般区段的长度选7、9、11或13个氨基酸均能获得理想的结果。;蛋白膜拓扑学研究常用方法;蛋白水解法 将含有要研究蛋白的生物膜制成取向一致 的脂质体（如Inside out Vescicle） ?加入蛋白水解试剂（如Trypsin、Thermolysin等） ? ? 加入抑制剂终止反应 ? 去垢剂溶解膜 ? SDS－PAGE电泳 ?片断分析 ;蛋白水解法实验中还需要注意： 蛋白水解抑制剂必须有效，有些蛋白酶很难被抑制，而且加入去垢剂后仍然保持活性，这样膜蛋白全部被水解，得不到结果； 可选用多种水解试剂实验，综合所得信息，另外，当实验出现阴性结果时，并不能说明蛋白没有膜外片断，只能说明蛋白没有膜外部分或有膜外部分但该部分没有水解位点； 在电泳检测方面，如果所研究蛋白本身占所用膜上蛋白总量的大部分，则可直接分析各主要电泳带；但若是研究蛋白只占膜蛋白总量的小部分，则必需用单抗或特殊的共价标记物来找出正确的电泳带分析。 ;蛋白膜拓扑学研究常用方法; 免疫方法: 免疫技术的基本思想是使处于脂质体内部的片断受到保护不与外界接触而膜外部分不受保护。由于使用特异性的单抗而使实验结果的分析相对简单。常用的方法是将单抗首先进行同位素标