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天然产物与 OATP1B1 相互作用的研究和 OATP2B1N-糖基化对功能和表达的影响 中文摘要 天然产物与 OATP1B1 相互作用的研究和 OATP2B1N-糖 基化对功能和表达的影响 中文摘要 有机阴离子转运多肽（OATP）1B1 是重要的肝摄取转运蛋白，介导很多内源性 物质和外源性药物转运到肝细胞。为了鉴别和研究天然产物中潜在的 OATP1B1 的调 节剂，本实验采用稳定表达 OATP1B1 的中国仓鼠卵巢细胞（CHO），在 96 孔板中测 定了 21 种常见天然化合物和提取物对 OATP1B1 介导荧光素甲氨蝶呤转运的影响。 该方法可进一步应用于高通量筛选大化合物库。结果表明：若干黄酮类化合物（如槲 皮素、槲皮苷、芦丁、菊花梗叶总黄酮和桑皮黄素等）和三萜类化合物（???甘草次酸 和甘草酸等）在体外实验中显著抑制了 OATP1B1 的转运功能，其 IC50 值均小于 16 μ M；黄酮类化合物比其对应的糖苷类化合物的抑制作用更强，而且糖的类型和糖链长 度对其抑制作用均有影响。为了考察这些化合物对 OATP1B1 介导其他底物摄取的影 响，我们建立了检测 OATP1B1 药物底物氟伐他汀和罗伐他汀的 LC-MS/MS 方法。研 究结果表明，天然产物对 OATP1B1 转运功能的影响具有底物依赖性。本论文的研究 结果将有助于预测和避免潜在的 OATP1B1 介导的不良药物-药物和药物-食物相互作 用，为临床合理用药提供实验依据和指导。 有机阴离子转运多肽 2B1（OATP2B1）表达在胎盘、肝脏、乳腺、脑和肠等组织 中，介导四溴酚酞磺酸钠、3-硫酸雌酮和 3-硫酸脱氢表雄酮等的转运。糖基化是一种 重要的蛋白翻译后修饰，OATPs 的共有结构特征—潜在的 N-糖基化位点位于胞外环 2 和 5 上。为探究 OATP2B1 上 N-糖基化对其表达及功能的影响，我们首先使用生物 信息学软件预测 4 个潜在 N-糖基化位点，并该对应位点处的将天冬酰胺突变成谷氨 酰 胺 ， 得 到 四 个 单 突 变 （ N146Q 、 N176Q 、 N350Q 和 N538Q ） 和 一 个 双 突 变 （N176/538Q）。然后对于这些 OATP2B1 突变体的功能和表达的评估实验在 HEK293 细胞中进行。结果表明： OATP2B1 上的天冬酰胺 176 和 538 是糖基化位点。当这两 个位点被分别突变时，均使得蛋白水平降低以及转运活性显著降低；当两个位点被同 I 中文摘要 天然产物与 OATP1B1 相互作用的研究和 OATP2B1N-糖基化对功能和表达的影响 时突变时，蛋白水平显著下调，同时转运功能基本丧失。这表明 N-糖基化对 OATP2B1 的功能和表达非常重要。 关键词：有机阴离子转运多肽；天然产物；药物-药物相互作用；液相色谱-质谱； N-糖基化 作 者：石美智 指导老师：贵春山 张洪建 II 天然产物与 OATP1B1 相互作用的研究和 OATP2B1N-糖基化对功能和表达的影响