第5章蛋白质结构技巧.ppt

第五章 蛋白质结构解析;人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？;蛋白质三维结构解析方法 X-射线晶体衍射法：85.3% 核磁共振波谱：14.7% 电镜三维重构、各种光谱技术、显微 技术和计算机模拟 ;蛋白质三维结构解析过程;1895年11月8日 ,德国物理学家，50岁的伦琴在自己的实验室中偶然发现 一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，由于对管子发出的“东西”性质不确定，伦琴就把这种射线命名为“X射线” 。;人类第一张X光照片; 　　1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告。Kolliker教授提议将该射线命名为“伦琴射线”,但伦琴却说：“我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是称它为X射线最恰当。” ;1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有17封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金 ;X射线本质;;X射线衍射;;X-射线晶体结构分析基本原理 ;;;20世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获 得诺贝尔奖； 20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻； 20世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位； 20世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位； 今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。;Ｘ射线衍射用于蛋白质结构的测定;1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构;; 1959年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.55分辨率的晶体结构 ;;;1997年,核小体八组蛋白结构 2004年,菠菜捕光复合物LHC-II;2005年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构;X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计提供了全新方向;施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期;蛋白质X射线晶体结构测定程序 ;1、样品制备 ;2、蛋白质结晶和晶体生长;蛋白质晶体生长的影响因素;蛋白质结晶方法 ;（1）批量结晶法（Batch crystallization）;（2）透析法( Dialysis ) ;（3） 液相扩散法(Liquid diffusion) ;（4） 气相扩散法（Vapour diffusion）;（5） 结晶新方法 Nucleant 生物玻璃;晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等;3、衍射数据收集和处理;上海同步辐射中心;晶体收集和储存;4、位相求解 ;分子置换法(MR);多对同晶型置换法(MIR);多波长反常散射法(MAD);5、模型建立和修正; X-Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法 优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构 缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息 ; 成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。 目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。 ;; NMR基本原理;15;;;核磁共振波谱仪; 核磁共振波谱仪;3 ．射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。 ;如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。;核磁共振法中几个常用的参数;1.化学位移 ;2.耦合常数 ; 3.NOE信号强度 ;4.谱峰面积 ;5.弛豫时间 ; 二维核磁共振(2DNMR）; 多维核磁共振;核磁共振技术的应用;1985年,维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质———蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构; NMR图谱得到的蛋白质三维结构; NMR的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶体衍射互为补充.;核磁共振成像;核磁共振测深; 优 缺 点;NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤:;;X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系 NMR法一般只能解析相对较小的蛋