第5章荧光法与化学发光法技巧.ppt

第5章 荧光分析法与化学发光分析法 5.1 荧光分析法 5.2 化学发光分析法 相关定义 特点 荧光分析法：灵敏度高、选择性好 化学发光分析法：灵敏度高；线性范围宽；分析速度快；仪器设备简单，不需要光源及单色器等；没有散射光及杂散光等引起的背景值。 5.1 荧光分析法 5.1.1 基本原理 5.1.2 影响荧光强度的因素 5.1.3 荧光分光光度计 5.1.4 分析方法 5.1.5 应用示例 5.1.1 基本原理 1．分子中电子的激发过程 2．分子荧光的产生 3．荧光光谱的类型和特征 1．分子中电子的激发过程 2.分子荧光的产生 振动弛豫 内部能量转换 荧光发射 外部能量转换 体系间跨越 磷光发射 3．荧光光谱的类型和特征 1）激发光谱和发射光谱 2）荧光光谱特征 1）激发光谱和发射光谱 硫酸奎宁的激发光谱（a） 及荧光光谱（b） 2）荧光光谱特征 （1）Stokes位移 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 （3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 蒽的激发光谱和荧光光谱 蒽的能级跃迁 与UV比较 相同点 λ区段：Vis-UV区 适用性：均可用于定性定量，多用于定量 定量方法：相似 样品性质、量：以液体为主、均少 分析时间：均快 操作难易程度：易 与UV比较 不同点 5.1.2 影响荧光强度的因素 1．荧光效率与荧光产生的条件 2．影响荧光强度的结构因素 3．影响荧光强度的外部因素 1 荧光效率 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示： φf 0~1 φf 大的有荧光发射 （2）产生荧光的必备条件 强紫外-可见吸收 一定的荧光效率 π→π*跃迁 强吸收带 n →π*跃迁 弱吸收带 存在共轭的π→π*跃迁， φf高，荧光强度大。 2．影响荧光强度的结构因素 1 共轭效应 2 分子的刚性与共平面性 3 取代基效应 1 共轭效应 绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，因为芳香环或杂环分子具有长共轭的π→π*跃迁。π电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。 苯 萘 蒽 λ ex 205nm 268nm 356nm λ em 278nm 321nm 404nm φf 0.11 0.29 0.36 2 分子的刚性与共平面性 在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光率越大，并且荧光波长产生长移。 3 取代基效应 第一类取代基：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－NR2、－CN等 第二类取代基：－COOH、－NO2、－C＝O、－NO、－SH、－NHCOCH3、－F、－Cl、－Br、－I等 第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等 3．影响荧光强度的外部因素 温度 溶剂 pH值的影响 荧光熄灭剂的影响 散射光的干扰 温度和溶剂 温度：温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小，荧光强度减小 pH值的影响 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为弱酸弱碱分子和它们的离子结构有所不同，在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，因此荧光强度有差异。 苯胺在不同pH值下有下列平衡关系 荧光熄灭剂 荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂。 常见的荧光熄灭剂 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物 荧光熄灭的形式： a、碰撞、 b、生成不发光配位化合物 c、荧光物质氧化 散射光的影响 瑞利散射光 拉曼散射光 干扰荧光测定，应采取措施消除 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱 5.1.3 荧光分光光度计 1. 激发光源 高压氙灯 ——强谱线的连续光谱 连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波长之间的谱线强度几乎相等 汞灯 ——线光谱 高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm 2. 单色器 激发单色器---除去不需要的光线 发射单色器---选择不同的荧光发射波长 3. 样品池 低荧光的玻璃或石英 方形适用于90°测量 4.检测器 光电倍增管 5.读出系统 数字电压表 记录仪 带有计算机控制的读数装置 5.1.4 分析方法 1．荧光强度与物质浓度的关系 F K’·φf·I0（1-e-εbC） K’——仪器常数，φf——激发光强度 当C很小时，A εbC≤0.05时， e-εbc 1-εbc F k’·φf·I0