蛋白质相互作用方法详解.ppt

蛋白质相互作用研究方法简介;基因组序列测定→后基因组研究时代 编码功能蛋白的基因不到三万条 已知蛋白的功能，新基因的功能探索 蛋白质功能研究或蛋白质组学研究 蛋白质相互作用研究方法作为技术平台 蛋白在发挥作用时都不是孤立的， 而是相互联系的;一种蛋白的功能必须借助于其它蛋白的调节或介导。这种调节或介导作用的实现首先要求蛋白质之间有结合作用或相互作用。如果找到与已知蛋白有相互作用的其它蛋白（不管这种蛋白是已知的还是未知的），那么这种已知蛋白的功能研究有可能进入一个新的天地。对于新基因 情况也是如此。 ;Yeast two-hybrid System;原理;实际应用中，把 GAL4 基因分成两个部分：DNA结合区（gal4 DNA binding domain, GBD）和激活区(gal4 activating domain, GAD）。分别把 GBD 和 GAD 构建到两个不同的载体上，并能表达相应的两个融合蛋白（GBD-X ??? GAD-Y）。 自激活作用检测： 　GBD-X和GAD 　GAD-Y和GBD 阴性对照 　GBD 和 GAD GBD-IL2和GAD-IL2R（例如） 阳性对照;然后把 GBD-X 和 GAD-Y 两种载体共转染到带有报告基因的酵母细胞中。当 GBD-X 融合蛋白中 X 蛋白与 GAD-Y 融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时（或结合在一起时），就使得原本分开的 GBD 和 GAD 蛋白靠近并具有完整的 GAL4 蛋白的功能，从而能够激活报告基因的表达。 ;UASs, upstream activating sequences AD, activating domain BD, binding domain;;Yeast Phenotypes;应用;二.确定参与结合作用的 domain 或 motif;Figure 1. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. C) The indication of yeast cells containing vectors in each pie slice of the culture plate. D) Growth of transformants coexpressing HPO and JAB1 on selective leu–/trp–medium. E) Growth of transfected yeast cells on leu–/trp–/his– medium. ;;;;Pull Down Assay;;;原理;;GST/HIS融合蛋白与重组蛋白的相互作用;30 kD? 15 kD?;GST/HIS 融合蛋白与体外 TNT 系统合成的多肽或蛋白的相互作用 体外TNT系统合成Y，且可在Y上加上标签 anti-Y antibody 或 标签抗体检测 X-Y结合力弱时,S32标记 Y,放射自显影;GST/HIS融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用;GST融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用;待测蛋白的磷酸化状态可能产生影响;Co-Immunoprecipitation (co-IP);co-IP;原理;细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀;;Figure 3. The Cys→Ser mutation of HPO destroying its enzyme activity disturbed neither HPO dimerization nor HPO-JAB1 interaction in vivo. COS 7 cells were cotransfected with JAB1 and either Myc-tagged HPOs (wild type or mutants) or Myc control vector. The cells lysates were incubated with a rabbit anti-JAB1 antibody then with protein A/G–Agarose. The immuno-complex was resolved on 15% SDSand analyzed by immunoblotting with anti-Myc antibody. As an indication of the relative expression level for Myc-HPO, some of the total cell