第4章 细胞培养的基本技术.pptVIP

第4章 细胞培养的基本技术;教学目的;一、基本操作技术和要求;一、培养室内的无菌操作;（一）无菌操作 培养前准备：准备好所需物品清点无误放置操作场所。 培养室和超净台消毒：0.2％新洁尔灭拖地 紫外线照射30-50min/d 75% alcohol擦洗台面 紫外线消毒 勿照射培养细胞和培养液;洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，操作前75％alcohol消毒 无菌培养操作：整个实验过程保持无菌操作。点燃酒精灯，一切操作在火焰附近烧灼进行。 烧灼时间勿过长防止退火。 洗过培养液的吸管不能再烧灼。 橡胶物品不能烧灼时间过长。 吸管不能混用。;（二） 培养细胞的取材 1.基本要求： “快” ，少于24h “无菌” 用锋利的器械切取组织减少损伤 血液，脂肪，神经组织等要弃去 培养液营养要丰富，胎牛血清10-20％ 成功率：胚胎组织成熟个体 肿瘤组织正常组织;2.基本器材和用品 眼科组织剪刀 弯镊 手术刀（消毒） 装有无血清培养基 或Hank’s液的小瓶 小烧杯 培养皿;3.取材 皮肤粘膜取材：上皮细胞培养来源 内脏和实体瘤：体内所发生肿瘤及各脏器是常用材料 血细胞：静脉，耳垂或手指取血，肝素抗凝 骨髓，羊水，胸水，腹水：离心后立即培养。; 鼠胚组织：引颈法处死 整个浸入75％alcohol5min 固定于木板取材 鸡胚组织：将蛋以气室向上置烧杯中消毒 剪刀环行剪开蛋壳 玻璃棒挑出鸡胚 ;（三）组织材料分离 细胞悬液： 500-1000rpm低转速离心 5- 10min 组织块： 机械分散法: 剪刀剪取后反复吹打 剪切分离法：剪或切成1mm3培养 消化分离法：; ⑴胰蛋白酶法 使用最广泛。适宜消化间质少的软组织如肝肾等，对硬癌组织效果差。所需时间较短，主要缺点是破损细胞。;⑵胶原酶解离细胞法： 对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。 价格较高，大量使用增加成本。 ⑶EDTA法： 较胰蛋白酶作用缓和，适宜消化分离传代细胞。;二、原代培养;;;;;1000ml;;2.消化培养法： 快速得到大量活细胞，适宜培养大量组织，原代细胞产量高。 步骤繁琐，易污染，一些消化酶成本高，价格昂贵。;3.器官培养： 从供体获得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外进行培养。 要求： 特殊培养条件 r1mm 足够氧气渗入;三、传代培养和细胞系的维持;2.细胞传代方法 贴壁生长：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 悬浮生长 离心法传代 直接传代法 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。;3.细胞系的维持 “换液” 传代” “再换液” “再传代” “细胞冻存” 4.培养细胞的纯化 ⑴自然纯化：利用某种细胞增殖优势排挤其它细胞。无法人为选择，时间长，适于恶性肿瘤。; ⑵人工纯化： 酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同。 机械划除法：用橡皮刮子或弯头滴管直接从瓶壁刮除。;反复贴壁法：利用上皮细胞和成纤维细胞贴壁时间和稳定性不同。 培养基限定法：某些细胞在生长过程中必须存在或去处某种物质。 流式细胞仪分离法：利用细胞核酸含量，某些物质含量或细胞结构大小等参数分离。;5.原代培养细胞的生命归宿 原代培养期 传代期 衰退期;五、细胞冻存、复苏和运输;细胞的冻存、复苏和运输;□1776年Spallanzani最早发表了“冷”处理对马精子生命活动的影响的报道，用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后，再将玻璃瓶放回室温下，精子又“复活”. □1900年前后，基本肯定生物成分能够在零下温度贮存的事实。 □1949年至1960年称“甘油时期”。 □1959年：二甲亚砜（DMSO）;;2）复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程 3）因细胞内部结冰而致的细胞损伤被称为细胞内冰晶的损伤(intracellular icedamage)。 4）保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤或称溶液损伤(solution damage);原则：慢冻快融; ;细胞冻存所用用品;⑶慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃