杀菌剂生物测定教案.ppt

第三章 杀菌剂生物测定技术 ; 杀菌剂室内生物测定的主要内容是将杀菌物质作用于细菌、真菌或其他病原微生物，根据其作用的大小来判定药剂的毒力。或将杀菌物质施于植物，对病害发生的有无或轻重观察比较来判定药剂的效果。;供试病原菌要求 在分类上有一定代表性，最好是重要的农业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。;番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）;水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae）等。; ; 4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析;孢子萌发法 　　　　　　　　　　管碟法 含毒介质培养法　　　滤纸片法 　　　抑菌圈法 　　　　　　　　　　孔碟法 　 　　　　　　　　　生长速率法 　　　　　　　　　最小浓度法 叶碟法 ;　 孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用的杀菌剂毒力测定方法。早在1807年。Prevost 就采用此法，后经不少学者改进，使之日趋规范、合理。 　;原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻片上），在保温，保温条件下培养一定时间后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。 ;　 以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养，培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低倍镜下，每处理随机检查200个孢子。 ;孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。 　　　　　　　　　　对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100 　　　　　　　　　　　　对照萌发率 ; 将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y；药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归，求得回归方程Y＝a+bx，可得LC50和LC95.。;孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）　 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）;2.含毒介质培养法;　　　基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基（通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大小来比较不同杀菌剂的毒力大小。 ;抑菌圏法的优点 精确度高 操作简单 抑菌圏法的缺点 溶解性 扩散性;抑菌圈法示意图;; 根据施加药剂在洋菜培养基表面的方式，抑菌圈法又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。;（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列梯度浓度，一般5~7个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜（15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。 ;（3）待培养基冷至50℃左右（凭经验估计），迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后，倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。 ;（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1个管为对照，