第七章 细胞培养技术.doc

第七章 细胞培养技术 细胞培养(cellculture)是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理 环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长和繁殖，并维持其结构 和功能的方法。由于体外培养的细胞其结构和功能接近体内情况，便于使用各种技 术和方法进行研究，并能在较长时间内直接观察细胞生长、发育、分化过程中的形 态和功能变化，而且可同时提供大量生物学性状相似的细胞作为研究对象，因此， 细胞培养已经成为现代医学研究中一项非常重要的技术。但是，细胞培养作为一种 研究技术也有其局限性，主要是细胞离体以后失去与其周围环境的密切关系，其生 物学性质必然会发生某些改变，该因素也不可忽略。 近年来，细胞培养技术已广泛地应用于生物学的各个领域，如细胞生物学、分 子生物学、遗传学、药理学、免疫学、细胞工程、老年学、肿瘤学和病毒学以及临床学 科基础研究，并取得了丰硕成果。 细胞培养不但是一门技术，而且是一门科学，它有基本理论、基本知识和基本 方法。为了使学生更好地掌握这门技术，我们在本章中主要介绍以下内容：细胞培 养的基本原理与技术；细胞的原代培养和传代培养；培养细胞的一般观察方法；培 养细胞增殖动力学方法和培养细胞的冻存技术等内容。 第一节 细胞培露的基本原理与技术 细胞培养不但是一门技术．也是一门科拿，有专门的理论、技术和方法。要想更 好地学习和掌握细胞培养技术，应该首先学习细胞培养的基本原理与基本技术。 细胞培养的基本技术 [目的要求] (1)掌握体外培养细胞的生存条件。 (2)熟悉培养用品的清洗与消毒原则。 (3)初步了解无菌操作的基本要领和要求。 [实验原理] 细胞培养是一种程序复杂、要求严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存， 必须模拟体内环境，供给细胞存活所必须的条件，如水、无机盐、氨基酸、维生素、葡 萄糖、生长因子(8rowth 5actor)等，还要受到温度、渗透压、pH等多种因素的影响。 细胞培养用品的清洗、培养用液的配制、除菌等均有严格的要求，持别是无菌操作， 是细胞培养成败的关键。为此．本次实验分两部分进行，理论部分重点介绍体外培 养细胞的生存条件、培养用品的清洗与消毒、无菌操作基本要领和要求及细胞培养 用液；实践部分分别在细胞培养室、细胞培养准备室进行。 [试验用品] co 2培养箱、超净工作台、电冰箱、离心机、倒置相差显微镜、普通显微镜、水纯 化装置、拍滤装置、电子天平、液氯题、洗刷装置、各类培养用品等。‘ t[内容与方法] (一)培养细胞的生存条件 体外培养细胞所需要的生存条件和物质代谢 生存环境的改变也会出现一定的差异。 1.水的质量 水对维持培养细胞的生命活动是十分重要的。体外培养的细胞对水的质量非 常敏感，在培养用液中任何对细胞有害的物质都会影响培养细胞的生存。因此，要 求培养细胞用液必须使用新鲜三蒸水或去离子水配制。 2．天蓖环境 防止污染是保证细胞在体外存的基本条件之一。在培养环境中不得有细菌、病 毒、支原体、真菌或其他微生物的存在，因此，在细胞培养过程中要努力做到最大限 度的无菌。要保持无菌环境，必须严格做到：细胞培养用品要经高压灭菌处理后才能使用，培养用液要经过除菌处理，实验过程要严格按照无菌操作规程进行。 3．温度 适宜的温度是保证细胞在体外生存的重要条件，人和哺乳动物的细胞员适宜 的培养温度为36．5℃土o．5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响， 甚至死亡。一般来说，培养细胞对低温的耐受性比对高温要强。温度不超过39℃时， 细胞代谢的强度与温度呈正比。培养温度高至41—42℃时，细胞只能生存很短的一 段时间，10一24h后即行退变或死亡。培养温度低至25—35℃时，细胞仍能生存和 生长，但速度缓慢。细胞在4℃能存活数天，若温度降至冰点以下，则细胞可因胞质 结冰而死亡。 4．渗透压 人血浆渗透压约290 mm01／L(290 mOsm／k8)，可视为培养细胞的理想渗透 压。对大多数细胞来说，渗透压在260一320mm01儿(260一320 mOsm儿8)范围都 适宜。 多数培养细胞的适宜pH为7．o一7．4，偏离此范围会对细胞产生有害影响。但 各种细胞对pH的要求也不完全相同，一般情况下原代培养的细胞对pH的变动耐 受差，连续性细胞系(株)耐受性强。总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些。 细胞培养中02和cO s是细胞生存所需要的重要条件。02参与三羧酸循环可 为细胞提供能量。c02既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，并与维持培养液的 pH有直接关系。 体外培养的细胞所需营养必须从培养液中获取。当前在细胞培养中，广泛