讲义2 基因诊断.pptVIP

基因诊断Gene Diagnosis ; 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的;基因诊断: 采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。 检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。 ;基因诊断的原理;第一节 基因诊断的技术方法;一、基因诊断中常用的分子生物学技术; 核酸分子杂交：按照碱基互补配对原则，将不同来源的序列互补单链的DNA/DNA，RNA/RNA，互补配对成双链杂交分子，这一过程叫核酸分子杂交。; 一、原位分子杂交技术 DNA变性: 当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下, 维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离 成两条单链,这一过程叫DNA变性。 DNA复性: 当温??降低至合适温度或恢复pH值至中性，两条裂 解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一 过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。;; 原位杂交：用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原位进行 (in situ hybridization)杂交,叫原位杂交。可用 于DNA、RNA定位研究。;荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）;印迹技术的类别及应用;Southern 印迹杂交用于基因探测的基本过程 Southern印迹杂交常用于探测DNA的限制性内切酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性内切酶图谱的变化，可判断是否发生了明显的DNA突变。具体方法图示如下：;组织或细胞 ;三种印迹技术的比较;分子杂交实验;放射自显影照片;核酸分子杂交;;获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件。杂交双链的稳定程度主要由其Tm值（熔解温度）决定。影响杂交双链Tm值的因素包括以下几个方面：;在液相体系中，完全配对的核酸双链的Tm值可以下列公式估计： ;寡聚核苷酸 Tm(0C)＝2（AT碱基对数）＋ 4（GC碱基对数） （适用于10～30bp） Tm(0C)＝81.5 + 0.41×(G-C)% + 16.6×logM－600/L （适用于14～70bp） ? 其中M为单价阳离子（通常为Na+）浓度, L为杂交双链的长度，以碱基对计算。这些公式适用于0.01~0.4mol/L Na+浓度及30－75GC％。 ? 在无变性剂存在的条件下，最适杂交发生在比DNA/DNA Tm低20－250C，比DNA/RNA Tm 低10－150C。 在固液体系中，杂交条件对杂交双链Tm值的影响更为复杂，一般低于按上述公式得到的计算值。 ;(二) 聚合酶链式反应（ PCR polymerase chain reaction); 具体过程： ① 变性：将双链DNA加热（95℃）使之变性，DNA双链 变成单链 ② 退火：降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合 ③ 延伸：将温度升至72℃，在DNA聚合酶作用下，在引 物3’端进行延伸，使原模板DNA的一条链变成 两条链。;5?;Cycle 3;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;（3）、PCR的基本反应步骤;（三）、单链构象多态性(SSCP) 分析;PCR/单链构象多态性分析（SSCP）;;四、限制酶酶谱分析;㈤ DNA序列测定;DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。;;二、基因诊断的基本方法;㈠基因突变的诊断;;;2 .大片段丢失或插入的诊断 外侧确定有无缺失及缺失片断的相对大小 内侧确定缺失部位. ;㈡多态性连锁分析;;;㈢基因表达异常的诊断;㈣ 外源DNA检测;第二节 基因诊断的应用;;一、遗传性疾病;×;+; 遗传性疾病----DMD的分子诊断;DMD基因外显子缺失的检测;二、感染性疾病基因诊断的策略;SARS相关冠状病毒的分子诊断; 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 30