动物细胞培养概论.ppt

动物细胞体外培养Animal cells?cultured in vitro ;一、基本概念;（1）原代培养 ( Primary Culture ) ： 亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进 行培养的过程。 （2）继代培养（ Secondary Culture ）： 亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称 继代培养. （3）细胞系（cell line）： 由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞 为主、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，能保 持一致的二倍体核型。 （4）细胞株 ( cell strain ) ： 细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞 群体。;二、动物细胞体外培养特性;1.与体内主要不同相对孤立、相对单一，缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 ； 2.主要表现：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，细胞趋向单一化； 3.提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。 ;三、体外培养细胞的生长与增殖过程;1、原代培养期（primary culture phage) 为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段,一般持续1~4周。细胞的代数=转接的次数。每一代中细胞分裂3-6次。 2、传代期 （passage phase）： 当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。 ;;;;细胞浓度的对数;四、动物细胞培养基本技术;净化工作室;风淋室:　　风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35℃较为适宜。;传递窗:　　该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。　　;超净工作台; 紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑料培 养皿和培养板等表面消毒 ;大容量高压灭菌器 ;电热干燥箱：干热消毒（160 ℃ ，2小时）。主要用干 玻璃器皿消毒 ;滤 器;自动三重纯水蒸馏器 纯水仪;培养皿、培养板;培养瓶;CO2培养箱;移液器;离心机 ;;酶标仪 微孔板震荡器;液氮罐;（二）动物细胞的体外培养一般条件;;血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 ;;(三) 体外培养的一般过程;;过程 ;1、取材;2、组织的分离;（2）消化分离法; 3）EDTA 消化法： EDTA是一种非酶性消化物，常用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS 配成0.02%的工作液。 关于 EDTA的作用机制一般认为是：一些组织，尤其是上皮组织，在生存中需要 Ca2+和 Mg2+才能维持组织的完整性。 EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子，形成螯合物，能促进细胞相互分离。;（1）原代培养分为两种： 1）组织块培养 2）组织消化培养 ;基本步骤：无菌取出目的组织 ;机械分散组织法;组织块培养法;; 取材分离和组织消化 ;相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用; 接种、培养 ↓ 常规检查 （检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染）; 传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。 第一次传代时间：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。 ;基本步骤： ;;2）悬浮生长细胞传代;5、细胞的冻存复苏;（2）冻存和复苏的原则：慢冻快融;（3）保存细胞三要素：营养、保护剂和低温;细胞冻存方法;冷冻管;程序降温冻存盒;（4）细胞复苏方法;六、 培养细胞的检测和特性鉴定 ; 1、细胞形态 生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看清细胞的细微结构。细胞机能不良