23-纤维素酶.ppt

国内菌种诱变选育情况 王家林等对康氏木霉NT-15进行紫外线、电磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理、化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15-H,固体培养滤纸活力为3670u/g, Cx酶活力1800U/g，此菌种在工厂化生产中性能稳定。 第23讲 纤维素酶 张苓花等采用康氏木霉W-925经过硫酸二乙酯和紫外线复合诱变，筛选得到产酶活性高的菌种Wu-932 ，该菌种CMC糖化力达到2975 u/g，滤纸糖酶活性为531U/g，比出发菌W-925分别提高了100%和81%。 化工部饲料添加剂技术服务中心采用里氏木霉A3进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双层平板上，30℃培养5-8天，15℃放置7-10天，挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。 第23讲 纤维素酶 中科院微生物研究所董志扬等用康宁木霉通过γ射线照射和亚硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素酶高产菌株T801，其产酶能力提高1.77倍。 青岛海洋大学管斌等对里氏木霉进行低剂量、反复多次紫外线、亚硝基胍复合诱变处理方法，用“以2-脱氧葡萄糖作为降解产物阻遏物”高效筛选方法，选育得到一株抗分解代谢阻遏的突变株，纤维素酶活力提高三倍。 第23讲 纤维素酶 纤维素酶基因工程菌构建 20世纪80年代以后一直至今，以纤维素酶过量生产为主要目的，构建高产纤维素酶基因工程菌的研究十分活跃。 目前里氏木霉 T reesei 纤维素酶中的 内切酶：EGI、EGIII和EGV基因 外切酶：CBH I , CBH II， β-葡萄糖苷酶：βGI，βGII 等纤维素酶中各组分蛋白分子量，氨基酸残基组成，基因长度与序列均已被调查清楚。 第23讲 纤维素酶 纤维素酶基因工程菌构建策略 由于纤维素酶是一个多酶体系，要得到一个有实际应用价值的纤维素酶，大多采用产纤维素酶菌种Trichoderma reesei为外源基因的表达宿主，采用基因工程手段改造里氏木霉，提高产酶活力。 1、通过扩增内切酶或外切酶蛋白基因的拷贝数， 2、外源β-葡萄糖苷基因转入到里氏木霉 3、引入高比活的外源内切酶或外切酶基因，强化内切酶或外切酶的活性，可获得改变纤维素酶系组成和高活性的纤维素酶工程菌。 第23讲 纤维素酶 如： 1、国内某公司利用采用厌氧真菌Orpinomyces的高比活（220U/mg）内切纤维素酶基因CelB，转入到里氏木霉中，筛选高产菌株，发酵CMCase酶活达到400-1200 IU/ml。 2、诺维信公司把米曲霉的β-葡萄糖苷基因转入到里氏木霉 Rut C-30，得到高β-葡萄糖苷酶活性表达量的里氏木霉SMA135-04，该纤维素酶有利于对纤维素的水解。 第23讲 纤维素酶 浙江大学化工与生物工程系，采用里氏木霉Trichoderma reesei ZU-02，提取木糖后的玉米芯残渣为碳源，最适底物浓度为研究了40 g/l ，最适C/N 比为8.0，500 ml三角瓶摇瓶发酵 7天，纤维素酶活力为5.25 IU/ml 213.4 IU/g cellulose ，放大到30吨搅拌发酵罐，4天发酵，酶活达到5.48 IU/ml 222.8 IU/g cellulase 。 10% w/v 玉米芯残渣，用20 IU/g 底物加酶量,，水解率达到90.4% 第23讲 纤维素酶 江南大学利用里氏木霉Trichoderma reesei 高产突变株WX12，以纤维素粉、麸皮和豆粕为原料，30℃发酵，CMCase 达到600IU/ml，滤纸酶活FPase达到17 IU/ml 。 河南天冠企业集团采用里氏木霉R3 液体深层发酵，发酵过程采取分段控制pH 值、温度和溶氧的工艺,发酵120 h 酶活力最高, FPA 和CMC 酶活力分别达到48.9IU/ ml 和321.68IU/ ml。 第23讲 纤维素酶 美国能源部、国家再生能源实验室（NREL）总投资超过3000万元美元，与和杰能科GENENCOR、诺维信NOVOZYMES公司合作研发的生物基乙醇燃料项目中降低纤维素酶成本,提高酶活已取得了可喜的成果， 采用生物信息、直接进化等生物技术，将生产1加仑燃料级酒精所需纤维素酶的成本从最初超过5美元的水平降至仅需要耗费约10-18美分（实验室条件下），降低了约30倍的成本。 欧洲和美国最大酒精制造商之一Abengoa Bioenergy公司已于2006年在位于美国内布拉斯加州的生物废料分馏处理中试基地对诺维信酶制剂工艺进行测试。一旦实现该项目的商业化操作，将有助于减少对不可再生、基于石油的能源和原材料资源的依赖。 第23讲 纤维素酶 1、液体发酵： 机械搅拌罐发酵（分批发酵，流加发酵） 气升式罐发酵