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基因工程;二、表 达 篇 ;;据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达系统： 常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2．真核表达系统：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。;二．原核生物基因结构和表达特点 ;三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 ;四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： ;常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 T7和T5启动子：;核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。 AUG—SD间距离。 AUG后的核苷酸 ;;（一）非融合型表达载体 ;;非融合型表达载体----pPL-Lamda;（二）融合型表达载体 ;;位相载体----含有3种读码框的系列载体;Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物切割方便： pGEX-1?T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子 位相载体;1.小分子量或易降解，或对宿主有毒的 目的蛋白的表达 2.GST标签纯化树脂GST Resin纯化;（2）融合型载体----His融合;;;; pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。 该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对， 1.可用亲和层析(SPA)。简化下游工艺。 2.溴化氰裂解，不用酶;融合表达质粒pBG-2的结构;（4）融合型载体----Trx融合;（三）分泌型表达载体 1、主要元件： 启动子和SD序列 信号肽序列 ：SD下游，编码信号肽， 可引导蛋白跨膜 2、优点：分泌表达，避免降解。 ;分泌型表达载体----pINIII-ompA1;分泌型融合表达载体----pEZZ18;(二）真核表达系统 组成：真核表达载体 受体细胞 基因转移方式 ; 据受体细胞及表达载体的不同分为3种： 酵母表达系统 哺乳动物细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 ;1. 酵母表达系统;启动子： 醇氧化酶-1（AOX1）基因的启动子，这是目前最强，调控??理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等，均为整合型载体;;2.昆虫细胞表达系统;3.哺乳动物细胞表达系统;;哺乳动物细 胞表达系统;串联表达IRES, internal ribosome entry site