4_核酸序列资料.pptVIP

尹铁球ytqstar@163.com;Sangers Method;Sanger法第一步：加入复制终止剂;dNTP和ddNTP的分子结构式;;;If one ddGTP is added to 100 dGTP, DNA synthesis aborts at a frequency of 1/100 every time the polymerase meets a ddGTP ;Sanger法第二步：荧光检测;;Four separate reactions dNTP+ ddGTP, dNTP+ ddATP dNTP+ ddCTP, dNTP+ ddTTP Each ddNTP carries a fluorescence group, allowing us to “Read” the sequence directly from the gel.;*;DNA的测序仪示意图;引物标记法测序(Dye Primer);–;终止法测序(Dye Terminator); Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP : dNTP的比例。测序反应试剂由测序试剂盒中提供，反应体系可以根据实际情况调整， 一般反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1 : 3~4） ，比例高时，得到较短的产物。? 如果将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。需要先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 ; 高通量测序技术又称“下一代”测序技术（Next-generation sequencing technology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 该系统的测序原理是在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以对DNA序列进行实时测定。在测序时，使用了一种叫做“PTP”（Pico TiterPlate）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。??????; 测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。光信号实时被高灵敏度电荷耦合元件（Charge-coupled Device, CCD）捕获，通过对测序数据的分析，就可以准确、快速地测定模板的碱基序列。; 测序反应可分为四个部分： ① 文库制备：将基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，切割后的DNA经末端修复后，加上特定的共同接头（adapter），回收单链的DNA（ssDNA）； ② PCR扩增：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使每颗珠子带有自己特有的单一的DNA片段，然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶颗粒中，使每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，洗去乳胶物质，回收纯化磁珠上的片段；;③ 测序反应：将带有单链DNA的珠子与其他反应物混合后放入PTP板（fibre-optic slide）中进行后继的测序。PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获； ④ 数据分析：通过测序系统提供的生物信息学工具对测序数据进行分析。 与传统测序技术不同之处是，这种新型的测序方法不需要对细菌进行亚克隆或者单个克隆处理，整个测序反应都是批量进行的，而且该技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳。;;pyro=pyrophosphate焦磷酸 一种全新的基于酶级联反应的新型遗传分析技术; 一套完整的实验方案； 诸多领域的广泛应用…… ;PPi;Detection of the light; C G TT CC A CC T ;Genotypes are clearly distinguished;Tri- and tetra-allelic SNPs;Advantage of Py