生物工程期中：一二六章整理.docVIP

一、二章 一、基因工程的概念？主要步骤与原理都有哪些？ 基因工程技术：基因工程技术又叫基因拼接技术或DNA重组技术。将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌；实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 步骤：（切连转选扩） 1、获得目的基因 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。 从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆。 在筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。 原理： 分子遗传学原理（扩增外???基因）、分子生物学原理（调控原件的修饰）、生化工程学原理、微生物学原理（工程菌的增殖与生产） 二、基因获得的常用方法 基因分离的物理方法、鸟枪法、cDNA文库法、基因组文库法、基因的化学合成、聚合酶链反应技术（PCR） 表达系统：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫、哺乳动物、植物 PCR的过程及原理： 定义：聚合酶链反应技术是指在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物，以单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化，合成DNA互补链达到基因扩增目的的过程。 原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR技术反应周期包括三个步骤： 1、高温变性：通过加热使得复制双螺旋DNA变性分 离为单链，作为模板。（91℃，1分钟）。 2、低温退火：（约50℃，1分钟）使专门设计的一对寡核苷酸引物在此低温条件下分别与单链模板DNA两端的互补区段互补结合。 3、适温延伸：将反应混合物的温度上升到72℃，保温1分钟 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 cDNA文库：是以mRNA为模版，用反转录酶合成互补DNA的方法。其最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。 cDNA文库组建步骤如下： 1、分离表达目的基因的组织或细胞。 2、从组织和细胞中制备总RNA和mRNA 3、第一条cDNA链的合成 4、第二条cDNA链的合成 5、cDNA上接头的加入 6、双链cDNA与载体的连接 7、从众多的重组体中筛选出特定的基因 载体、工具酶： 表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？ 答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有1个，以便与外源基因连接。 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。 4、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号。 5、具有很强的启动子。 6、有很强的终止子。 常用载体有：细菌细胞的质粒、λ噬菌体载体、病毒载体。 限制酶：凡能识别并切割双螺旋DNA分子内特定核苷酸顺序的酶统称为限制酶。 识别顺序与切割方式均相同者，谓之同裂酶。它是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶。 衔接物连接法是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。DNA接头法：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 载体：细菌质粒、病毒DNA、噬菌体DNA 科斯质粒是人工构建的，含有λDNA 的粘性(cos)末端序列、质粒复制起始区及质粒一个抗药性标记的、兼具质粒与λ噬菌体DNA载体双重性质的特殊载体。应用科斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做科斯克隆 转化： CaCl2化学转化法、高压电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、脂质体法、细胞核的显微注射、激光打孔技术、基因枪法。 感受态细胞（Competent cells)：能从其周围摄入DNA的细胞称为感受态细胞。基因工程中，宿主细胞需经人工处理成能吸收重组DNA分子的敏感状态，才能用于转化，这种敏感细胞称为人工感受态细胞 转化程序：1、对数生长期的宿主细胞的获得2、CaCl2处理，转化3