W-B注意事项.docx

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳注意胶有剧毒（神经毒性）！！必须带手套，注意自身安全问题！！！在该实验室操作时，没带手套不要碰任何东西！！制胶模具的准备（根据厂家说明书）注意每次用完后要用洗洁精洗净，用水冲干净，模具上的脏物及洗洁精残留的SDS均会影响胶的凝固过程，影响胶的均匀性分别灌制分离胶和浓缩胶，分离胶浓度视目的蛋白的大小确定（7.5%～15 %）具体见试剂配方（分别试了12％及12.5％的分离胶两种浓度，推荐浓度为12.5％的分离胶），分离胶上样(注意是否有漏)、水封（速度要慢，防止稀释，要有枪头由一侧滑动至另一侧的动作）、静置半小时，将封闭用的水去除（剩余的水用滤纸吸干净），配浓缩胶，上梳，静置半小时，拔梳（小心，在running buffer中进行，速度要慢）观察梳形是否整齐。蛋白样本（加蛋白样本的量根据实验所需）加入4×加样缓冲液（见配方）及水，100°C煮5 min使蛋白完全变性，例：跑胶每个样本20ul（我们加样感觉加20ul会溢出，实验时选择加16ul），需含蛋白量80ug，80/蛋白浓度得到需要蛋白样本加样量X。加样缓冲液（4×sample buffer）加5ul，20－5－X即为加水量。煮沸时注意管口要封劳。如果有条件的话用封口膜。煮沸以后用离心机低速离心20秒左右，上样时要看清梳形，小心加样，防止交叉污染，100 V电泳30min浓缩胶，15