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第六章 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 试述分子生物学实验的主要技术和方法 答题要点： （一）载体 常用载体如下： 1．质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。 2．λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段，如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等。 （二）分子克隆常用酶 1．限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端： 1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’ 切割后产生两片段： ↑ 5’N N N N N C T G C A pG N N N N N3’ 3’N N N N N Gp A C G T C N N N N N5’ 这类限制酶主要有：BamH I、BglⅡ、EcoR I、Hind Ⅲ、Kpn I、Pst I等等。 2）平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：HaeⅢ识别双链DNA的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段： 5’N N N N N N G G pC C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C Cp G G N N N N N N5’ 这类限制酶主要有：HaeⅢ、Mst I、Sca I、Sma I等等。 2．DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等。 3．连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来，最常用的是T4噬菌体连接酶。 4．脱氧核糖核酸酶I。DNA酶I为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。 5．反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA链。 （三）重组载体 有了载体、酶和DNA片段，便可以重组载体。采用某限制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插入片段