核课件03.ppt

第五章 体外分析技术 ;伟大的Berson;体外分析发展史; 第一节 放射免疫分析  (Radioimmuno Assay,RIA) 是体外放射分析技术中建立最早、应用最广泛的一类技术，其基本原理是利用待测抗原与标记抗原与相应的特异性抗体的竞争结合，在抗原抗体的结合反应中，加入放射性核素标记的抗原，其与有限量的特异性抗体发生竞争结合。 ; 一、放射免疫分析的基本原理 RIA是竞争性体外放射分析的代表。  设：抗原（Ag）与标记抗原（*Ag）都能与Ab发 生竞争结合，并相互抑制。其竞争遵守质量作用 定律。 反应式如下：Ag + Ab Ag.Ab + *Ag *Ag.Ab + *Ag ;基本原理; 反应条件 1.Ab的量一定 2.*Ag 为过量 *Ag和Ag具有相同的免疫源性和反 应源性 3.Ag看作一价 只有一个结合位点，Ab也看作一 个结合位点的单克隆抗体 4.结合与离部分能有效分离开来 上述反应式中把B.F分离，以B/F，B%，F%为 纵座标，含 量为横座标可作标准曲线图。如用免疫反应动力学解释，所得标准曲线为一条曲线。;;;实验台;水浴箱;离心机;井型探测器和定标器;γ计数器; 二、基本方法 （以RIA为例） （一）试剂的制备1.标记抗原(labeled antigen)  标记物(labeled compound)　由放射性核素加以标记的物质或化合物。 *比活度（specific activity ） *免疫活性（immune activity） *放射化学纯度（radio chemical purity） *稳定性（stability） ; 2.抗体(抗血清，antibody,antiserum)(1) 滴度测定：稀释度越大，滴度越好方法： ①抗体按比例稀释 ②分别加入标记抗原测B/F值 ③选择结合50%的稀释度作 为该试剂的工作浓度， 此称滴度(titer)。 ;;（2）特异性交叉反应(cross reaction)率测定： 在样品中加入结构相似物质，观察对结果的影响程度， 干扰轻者特异性高。（3）亲和力(affinity)和亲和常数K值测定 K1 Ag.Ab 亲和常数 Ka =  K2　　 经推导　Ka＝（B/F)oAbo, B/F=Ka[(Abo)-B]----(a)（1）由上式（a)可见Ka值大的抗体B/F大，亦及曲线斜率大，B的微小变化不能使B/F发生改变，稳定；（2）抗体滴度小时灵敏度高，但曲线的斜度又不能太大，否则发生误差；（3）因些选择抗体时既要考虑抗体的Ka，又要考虑滴度，一般选择斜率450为宜，即合适的抗体浓度与结合浓度之关系。;3.标准品(calibration standard);（二）反应条件的选择;（三）分离技术(separation technique); （四）标准曲线(standard curve) ; 第二节 免疫放射分析  (Immunoradiometric Assay,IRMA);免疫放射分析的基本原理;;第三节 体外放射分析误差和质量控制 （室内、室间质控）; 误差分类 常见原因 监控方法及标准 系统误差 仪器故障 1.CB(偏差系数Bias) 试剂变质 CB = [（真值- X）/ 真值 ] × 1 实验方法设计不合理 2.准确度 操作程序反常