凝胶阻滞,EMSA资料.pptVIP

凝 胶 阻 滞Electro Mobility Shift Assay，EMSAGel Shift Assay; 凝胶迁移实验（gel-shift experiment）是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等特点，也是当前被选作检测特定DNA结合蛋白质的一种典型的方法。目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用 ;实验原理;EMSA: Principle;;; Gel-shift实验还可以用来研究发生上述结合作用的DNA序列的精确特异性，其方法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA（competitor DNA）。如果它与同位素标记的DNA结合是同一种蛋白，那么由于竞争DNA是极大量的，绝大部分蛋白质将被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由状态，所以就不会出现阻滞的条带；相反，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定的蛋白质结合形???复合物，结果在放射自显影图谱上就会呈现阻滞的条带。同样，在竞争DNA上已知的转录因子结合位点，事先引入一个或数个碱基突变，通过凝胶阻滞实验也可有效地评估这些突变对竞争DNA的功能及其与转录因子结合作用的影响。;R. Voll 09/01;R. Voll 09/01;1、实验前准备2、形成蛋白-探针复合物 3、制备凝胶，电泳 4、转膜 5、检测 ;1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备 ;2、检测（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗,注意整个检测过程避免膜干燥。（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）（4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温轻微震荡1 0min。（5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整）。