细胞生物学技术(二).ppt

第三节 显微技术;光学显微镜与电子显微镜的主要差别在所使用的光源不同，但分辨率却相差非常大： 光学显微镜的最大分辨率：0.2μm 电子显微镜的分辨率：0.2nm;一、显微镜的成像原理; 照明系统的波长是显微镜成像的重要因素，波长能决定被检测物体的最小极限。;1、分辨率（Resolution）;分辨率可用下面公式计算结果来衡量： D=0.61λ /N.A. N.A.＝ｎsinα 式中： λ =波长；n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口张角的1/2），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于90?，sin α 的最大值小于1。;;不同光源的波长;2、最大分辨率;3、分辨极限与放大率;二、光学显微镜;1. The Light Microscopy（LM）;光镜观察样本的制备;2、倒置显微镜;;3、暗视野显微镜（dark field microscope）;;4、荧光显微镜;;荧光显微镜和普通显微镜区别：;;;5、激光共聚焦扫描显微境（laser confocal scanning microscope）;;;;Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. ;6、相差显微镜（phase-contrast microscope）; 基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差（明暗差），从而提高了各种结构间的对比度，使结构变得清晰可见。 光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ，如再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，提高反差。;构造上，相差显微镜不同于光镜之处： 1、环形光阑（annular? diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2、相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。;;;;7、微分干涉显微镜（differential-interference microscope）;图2-10 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色） ;DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器???如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。;;二、电子显微镜;（一）透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM);;1、透射电镜的结构;;2、电镜制样技术;; 由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。;;Thin sections; Specimen Preparation for Electron Microscopy ;;通过连续切片达到被检样品的三维结构的重构 ;（2）负染色技术;;(3)冰冻蚀刻(freeze-etching) ;;;;（二）扫描电镜（Scanning electron microscope (SEM) ;;工作原理;; 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 ;;;;三、扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM) ;（一）工作原理;（二）主要特点;四、原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)