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现代分子生物学 复习内容
一、DNA的变性(Denaturation):指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。确切地就是维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。断裂可以是部分的或全部的,是可逆的或是非可逆的。DNA变性不涉及到其一级结构的改变。
1. DNA变形的条件:凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件,如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。
2. DNA变性后发生的变化:DNA变性后原来隐藏在双螺旋内部的发色基团,成为单链而暴露出来,使DNA的物理和化学性质发生一些列的变化,这些变化包括:
(1)DNA溶液的浓度大大下降。DNA双螺旋是紧密的刚性结构,变性后代之以“柔软” 而松散的无规则单股线性结构,DNA粘度因此而明显下降。
(2)溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变, 使DNA溶液的旋光性发生变化。
(3)增色效应或高色效应(hyperchromic effect)。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA 的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。
(4)生物活性丧失。
(5)浮力密度上升。
3. 引起DNA变性的主要因素:
(1)加热(生理温度以上)。加热使DNA变性后,在260nm处的紫外吸收值明显上升,一般当DNA加热时,在260nm吸收值先缓慢上升,到达某一温度后又骤然上升,其特点是爆发式的,变性发生的范围很窄,其相变过程用Tm值描述。
(2)极端pH值。当pH为12时,碱基上的酮基变为烯醇基,影响氢键形成,从而改变Tm值,当pH为2~3时,碱基上的氨基发生质子化,也影响氢键形成。
(3)有机溶剂、尿素和酰胺等。当环境中存在酰胺或尿素时,它们可与DNA分子中的碱基形成氢键,从而使DNA分子保持单链状态,以利于分子克隆的操作。
4. Tm值大小的影响因素:
(1)DNA的均一性。有二种含义,首先是指DNA分子中碱基组成的均一性,如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段,与天然DNA比较,其Tm值范围就较窄。其次还包含有待测样品DNA的组成是否均一的意思,如样品中只含有一种病毒DNA,其Tm值范围较窄, 若混杂有其它来源的DNA,则Tm值范围较宽。
(2)DNA的(G+C)含量。在溶剂固定的前提下,Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C碱基对越多,Tm值越高。
(3)介质中离子强度:DNA在离子强度较低度介质中Tm值较低,范围较宽;在高离子强度时,DNA的Tm值较高,范围较小。所以DNA在含盐的缓冲溶液中较为稳定。
二、DNA的复性(renaturation):指变性DNA 在适当条件下, 二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为 退火(annealing)。
1. DNA复性的条件:
(1)一定的离子强度:用以削弱两条链中磷酸基团之间的排斥力,通常用0.2-0.5M NaCl
(2)较高的温度:避免形成无规则氢键,但是不能太高,否则不能形成有规则氢键以维持双链结构。
2. 影响DNA复性的因素:
(1)DNA分子的复杂程度。DNA序列越复杂,复性越慢,所需时间越长。
(2)DNA的浓度。同一种DNA分子,浓度越高,互补链碰撞机会越多,复性越快。
(3)DNA片段大小。DNA片段越大,复性越慢,因此,在复性研究时,一般要将其剪切成400bp大小的片段,以增加复性速度。
(4)温度。复性速度与温度直接有关,温度不宜过低,一般在Tm=25℃
(5)阳离子浓度。在小于0.5mol/L浓度时增加盐浓度有利于复性。
三、基因
1.基因的顺反子概念:现代分子生物学文献中,顺反子和基因这两个术语互相通用。一般而言,一个顺反子就是一个基因,1500~2000个核苷酸,它是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构(因为任何一个基因都是突变体或重组体)。有结构基因与调控基因的划分,还有重叠基因和断裂基因的发现。
2. 基因重叠的方式:
(1)大基因内包含小基因。
(2)前后两基因首尾重叠。
(3)三个基因之间重叠。
四、基因组
1. 基因组的概念:基因组是指细胞内遗传信息的携带者-DNA的总体。基因组中不同的区域具有不同的功能,有些是编码蛋白质的结构基因,有些是复制及转录的调控信号,有些区域的功能尚不清楚。基因组结构是指不同功能区域在整个DNA分子中的分布情况。
2. 细菌染色体基因组结构的一般特点:
(1)通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起,形成一个较为致密的区域为类核。只
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