基础学习实验3-醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离Hb和cytC答案.ppt

综合性设计性实验-3;此实验共包括如下三个部分 第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测 第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳 第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定;第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测;Ezrin蛋白是食管癌细胞侵袭移动的重要蛋白； 活性与非活性状态的Ezrin蛋白与F-actin的结合能力不一样，对细胞形态有重要影响;甘露糖化修饰预测 ：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/ ;N位糖基化修饰预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/;O位糖基化修饰预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ ;豆蔻酰化位点预测：/tools/myristoylator/ ;乙酰化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/ ;磷酸化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ ;以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果;电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2. 分析某种物质的纯度及分子量;电泳的基本原理;待分离大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和形状。 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离； 缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。 电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。 支持介质的筛孔 ：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。 缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 ；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。;血清蛋白醋酸纤维膜电泳;各???电泳技术在临床检测分析方面有重要的作用;+;醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。;实验操作及注意事项;染色：通电完毕，镊子取出，浸于氨基黑的染色液中5分钟，立即放入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净，滤纸吸干，不要太干。 定量： 取6支试管，编号，分别用吸管吸取0.4N NaOH 4ml； 剪下膜上各蛋白质带及另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（空白带的宽度以最窄的条带为准）。将各条分别浸于上述试管内（注意管与蛋白带的顺序），用力摇动，使蓝色洗出，约半小时； 用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。;6. 计算： 光密度总和 T ＝ A+α1+α2+β+γ 白蛋白％＝A/T×100% α1球蛋白％＝ α1/T ×100% α2球蛋白％＝ α2/T ×100% β球蛋白％＝ β/T ×100% γ球蛋白％＝ γ/T ×100%;临床意义;聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳;以聚丙烯酰胺作为支持物，两性载体电解质在支持物内形成稳定的pH梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当与自身 pI的位置中聚合成一狭窄的区带而停留下来。;聚丙烯酰胺凝胶;等电聚焦电泳;在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液，其pH约为6.5左右)。所以载体两性电解质分子都带有电荷，只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等，净电荷为零。引入电场时，载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动，最终在分子净电荷为零的位置停止迁移，在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。;实验操作及注意事项;试剂;2. 电泳 将已聚合的凝胶去除水层，凝胶端加2％氢氧化钠消除凹面，垂直插入电泳槽中的橡皮管中； 在电泳槽中的上槽注入0.2％硫酸或5