恶性肿瘤组织微卫星不稳定性的研究.ppt

恶性肿瘤组织微卫 不稳定性的研究;微卫星(microsatellite,MS),是指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列, 又称短串联重复(short tandem repeat, STR)，是一种遍布于人类基因组的重复序列，一般为2～6个碱基重复，如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等，尤以(CA)n重复序列最为常见。;其长度由重复单位的拷贝数决定，是一类呈高度多态的遗传标记，不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆，而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。 ;遗传物质的突变是导致人类许多疾病(包括肿瘤)的主要原因,而引起遗传物质突变的直接诱因是不同类型的DNA损伤。其中多种原因造成的DNA双链分子的碱基错配是导致突变的主要DNA损伤类型之一。大量研究表明,从细菌、酵母到人体细胞都存在一种能修复DNA碱基错配的安全保障体系,;这种保障体系是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成,被称为DNA错配修复系统(DNA mismatch repair system,MMR)。人体细胞中由于MMR系统的存在,可保持遗传物质的完整性和稳定性,避免遗传物质突变的产生,保证DNA复制的高保真度。 ;微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是指由于复制错误(replication error, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失,也称RER阳性或RER表型。;1993年，Altonen等首次发现，在HNPCC细胞中存在高频率的MSI后，又有很多学者在多种肿瘤中发现MSI。MSI作为肿瘤遗传不稳定一个敏感的检测指标已逐渐被大家接受。;在以后的研究中，相继在肺癌，胃癌，白血病等其它肿瘤也发现微卫星不稳定性。Li等报道一组100例包括头颈部肿瘤，膀胱肿瘤及肺癌病例，用9个微卫星位点标记物筛选，发现3个及4个核苷酸重复序列更易出现插入或缺失，26例出现至少一个位点的改变。;显示微卫星不稳定性改变可作为肿瘤细胞的克隆标志，运用于肿瘤的检测。肿瘤常在抑癌基因位点出现染色体基因缺失，表现为等位基因杂合性丢失(Loss of heterozygosity),通过检测分析肿瘤杂合性丢失及其规律，可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因。 ;目前已发现RER+肿瘤主要有3类：一类为散发性结直肠癌,这一类肿瘤细胞核型为近二倍体,病人预后较好；另一类为HNPCC病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为MSI,与散发性结直肠癌比较,发病年龄较早；第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤,这一类肿瘤MSI发生频率相对较低。;近年来研究证实RER+是HNPCC、肺癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌的早期分子标志,也是慢性髓细胞性白血病的晚期分子标志,对肾母细胞瘤来说,不仅是晚期分子标志并与其恶性程度有关,对胃癌来说,不仅是其早期事件,而且与癌的恶性转移有一定联系。并发现MSI存在于病理证实为阴性的肿瘤旁切缘组织。 ;目前已经知道,RER+大肠癌有以下特性；(1)发病年龄早,35岁以下大肠癌患者RER阳性比例最高；(2)多位于右半结肠,易发生肠内或肠外其它器官的多发性肿瘤,多发性肿瘤RER阳性率(80%)明显高于单发性肿瘤(11%),;术后易再发其它原发恶性肿瘤；(3)DNA多为二倍体或近二倍体；(4)对某些化疗药物(如顺铂)有原发耐药性；(5)具有高突变特性,许多癌基因及抑癌基因(如RAS,p53,APC等)突变数目明显增多； ;(6)粘液腺癌多见,组织分化差,多浸润生长,肿块较大,但较少发生淋巴结转移,预后较好,而RER-的大肠癌多发生在左半结肠,多为多倍体。晚期胃癌、远端胃癌多为RER+,RER+表型在肠型和实体瘤中的频率显著高于印戒细胞癌；近端胃癌早期多为RER-。;这说明与RER+癌发病机制不同。因此,检测不同肿瘤的MSI,对深入认识肿瘤病的基因变化是十分有帮助的。目前,需大力开展对人体多种肿瘤MSI的检测,了解各种肿瘤与MMR基因突变的关系,弄清肿瘤中MMR基因的突变类型及作用方式,建立更为简便的基因突变的检查技术并应用了临床。 ;微卫星不稳定性的研究方法，目前主要以PCR技术为基础研究微卫星不稳定性改变，步骤为：(1)首先需确定特定染色体上特定微卫星位点标记，并根据其序列合成特异性引物。引物序列一般可根据特定位点直接从基因库中查询。（2）收集肿瘤组织及相应正常组织标本，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，提取基因组DNA。;（3）PCR扩增。（4）扩增产物的检测。常用凝胶电泳，溴化乙锭染色后在紫外灯下观察，或放射自显影及银染等方法观察。（5）判断结果。若肿瘤组织较正常对照组织出现某一基因条带消失或密度减少50％以上，可判断为杂和性丢失；若肿瘤组织出现基因条带的增多，即判断