微量凯氏定氮法.docVIP

微量凯氏定氮法 目的 1. 掌握应用微量凯氏定氮法测定样品总氮量/蛋白质的原理和方法 2. 学会使用凯氏定氮仪 原理 凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量。 含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被分别氧化成CO2和H2O，氮则转变为氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。 该反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂促进反应的进行。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下： NH2 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，可借助水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中的氢离子浓度降低；然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)即可计算出待测样品中的氮含量。 滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的蓝/绿色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。 本法适用范围0.2~1.0mg氮，相对误差应小于2%。 材料、试剂与器具 材料 鱼肉、血清等含蛋白质样品 试剂 1. 浓硫酸(化学纯) 2. 30%氢氧化钠(分析纯)溶液 3. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末 4. 混合指示剂：0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1%甲基红乙醇溶液200ml混合配成(贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏) 5. 0.0500M HCl 6. 硼酸-指示剂混合液： 2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1ml左右混合指示剂)。 器具 凯氏烧瓶 消化架 吸量管(1ml, 2ml) 量筒(10ml) 凯氏定氮蒸馏装置 微量滴定管(3ml, 5ml, 可读至0.02ml) 锥形瓶(50~100ml) 容量瓶(50ml) 操作步骤 ㈠ 消化 称取适量鱼肉样品加入50ml凯氏烧瓶(注意勿沾于瓶口或瓶颈上)。 加入硫酸钾-硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。 在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。 消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml (注意慢加，边加边摇)。冷却后将瓶内容物转入50ml容量瓶，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 ㈡ 蒸馏 1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。 蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下： 图1-1 凯氏微量定氮蒸馏装置 开放自来水龙头，使水E进入G，从K管流出(水不宜开得过大以免水从G管溢出)。开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10ml入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P1，则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般情况下如此重复洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用(可用pH试纸检查)。 A为蒸气发生室，P3为其开关，P1为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M相接，M管插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出，蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH, 二者反应产生氨，经M管进入锥形瓶由硼酸吸收。 2、空白蒸馏： 蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3即可。 取1个50ml锥形瓶，准确加入10ml硼酸-指示剂混合液，用表面皿复盖备用。 加样：用移液管吸取1ml蒸馏水，细心地由漏斗D倾入蒸馏室。 将盛有硼酸-指示剂的锥形瓶置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液。 用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭(水封)。 蒸馏：用酒精灯加热(注意防风以维持火力恒定)，待硼酸-指示剂变绿时开始计时；3~5min后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸馏2min，最后用蒸馏水冲洗导管外壁。 蒸馏完毕后取下锥形瓶，撤火，随即将蒸馏器洗净。 3、样品蒸馏：用移液管分别吸取两份1ml样品消化液，按上述操作步骤进行蒸馏(注意在加样后应用适量蒸馏水清洗漏斗)。 ㈢ 滴定： 用0.0500N标准盐酸溶液滴定蒸馏吸收液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。 ㈣ 计算 若测定的样品含氮量部分只是蛋白性，(如血清)则： 样品