聚合酶链反应技术答案.ppt

聚合酶链反应技术 Polymerase Chain Reaction; 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。由于通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 ;主要内容;第一节 ;一、聚合酶链反应技术的简史;;模板DNA;;;;;;;;; 在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min， 2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。;n;反应组成： （五要素） 模板（template） ??物(primer) 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异; DNA 聚合酶(DNA polymerase) - dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP - PCR buffer: 一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温PH8.3) ，1.5mM MgCl2 ;（六）PCR一般方案 1．50 ul PCR反应体系的组成 1）组成： ①样品DNA 0.1～1ug； ②正链引物（25umol/L）1.0ul； ③负链引物（25umol/L）1.0ul； ④脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul； ⑤10×PCR缓冲液 5.0ul； ⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul； ⑦Taq DNA聚合酶1～2.5u；⑧蒸馏的去离子水补至50ul。加入30ul石蜡油，短暂离心混匀。 2）对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。;2．PCR仪工作参数的设置 94℃ 30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循环30次，最后72℃延伸5min。 3．PCR产物的保存与检测 PCR产物于4℃保存，PCR产物检测。;四. PCR扩增产物的检测方法;(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途;(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） 不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息;PCR-RFLP法：;(三) 核酸探针杂交法 1．点杂交（dot blot） 2．反向点杂交（reverse dot blot） 3．微孔板杂交（microplate hybridization） 4．PCR-EIA：（RNA probe hybridization enzyme immunoassay, RPEIA） 5．Southern印迹杂交（Southern blot）;点杂交（dot blot）;反向点杂交(reverse dot blot);Southern印迹杂交(Southern blot);(四) PCR-ELISA;(五) 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP） 本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。;PCR-SSCP过程;(六) PCR-OLA法 (七) PCR产物测序 常用的方法: 双脱氧核苷酸链末端终止法 化学裂解法。 用途：科研 ;第二节 ;一. 常见问题及其分析;2．假阴性 假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。 (1)标本处理的原因。 ①处理标本时，靶DNA丢失。 ②处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。 ③标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。;(2)PCR试剂问题。 ①Taq DNA聚合酶失活。 ②Mg2+浓度过低或是没有加。 (3)PCR扩增过程中的问题 ①PCR扩增仪故障。 ②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。 (4) PCR产物鉴定中的问题 ①电泳