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聚合酶链反应技术
Polymerase Chain Reaction; 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术(即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术)之一。由于通过体外(试管内)扩增,可以将目的基因(或靶基因)片段百万倍的放大,从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度,理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 ;主要内容;第一节 ;一、聚合酶链反应技术的简史;;模板DNA;;;;;;;;; 在下一轮循环中,DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环,便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2-4min, 2-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。;n;反应组成: (五要素)
模板(template)
??物(primer)
预扩增核酸片段两端的已知序列,决定特异; DNA 聚合酶(DNA polymerase)
- dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP
- PCR buffer:
一般组成:50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温PH8.3) ,1.5mM MgCl2
;(六)PCR一般方案
1.50 ul PCR反应体系的组成
1)组成:
①样品DNA 0.1~1ug;
②正链引物(25umol/L)1.0ul;
③负链引物(25umol/L)1.0ul;
④脱氧核苷三磷酸(dNTP各2.5mmol/L)4.0ul;
⑤10×PCR缓冲液 5.0ul;
⑥MgCl2(25mmol/L)3.0ul;
⑦Taq DNA聚合酶1~2.5u;⑧蒸馏的去离子水补至50ul。加入30ul石蜡油,短暂离心混匀。
2)对照:阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。;2.PCR仪工作参数的设置
94℃ 30~60sec,55℃30~60sec,72℃30~60sec,循环30次,最后72℃延伸5min。
3.PCR产物的保存与检测
PCR产物于4℃保存,PCR产物检测。;四. PCR扩增产物的检测方法;(一)聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途;(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法(polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)
不同的限制性核酸内切酶有具识别的特异DNA序列,所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化,得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息;PCR-RFLP法:;(三) 核酸探针杂交法
1.点杂交(dot blot)
2.反向点杂交(reverse dot blot)
3.微孔板杂交(microplate hybridization)
4.PCR-EIA:(RNA probe hybridization enzyme immunoassay, RPEIA)
5.Southern印迹杂交(Southern blot);点杂交(dot blot);反向点杂交(reverse dot blot);Southern印迹杂交(Southern blot);(四) PCR-ELISA;(五) 单链构型多态性分析法(PCR-Single Strand Conformation Polymorphism,简称PCR-SSCP)
本法就是将PCR 产物双链DNA(dsDNA)变性为单链DNA (ssDNA),加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关,而空间结构又与ssDNA序列有关。因此,电泳结束后,ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。;PCR-SSCP过程;(六) PCR-OLA法
(七) PCR产物测序
常用的方法:
双脱氧核苷酸链末端终止法
化学裂解法。
用途:科研
;第二节 ;一. 常见问题及其分析;2.假阴性
假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。
(1)标本处理的原因。
①处理标本时,靶DNA丢失。
②处理标本时,杂质成分没有去除干净,带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。
③标本放置不当,模板发生降解(尤其是RNA)。;(2)PCR试剂问题。
①Taq DNA聚合酶失活。
②Mg2+浓度过低或是没有加。
(3)PCR扩增过程中的问题
①PCR扩增仪故障。
②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。
(4) PCR产物鉴定中的问题
①电泳
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