专题四__核酸鉴定技术.pptVIP

核酸鉴定技术;鉴定的内容;主要内容;核酸的物理化学性质;核酸的紫外吸收;;;;DNA或RNA纯度的测定 对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值来确定，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。 样品中如含有蛋白及苯酚等，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作准确的定量测定。;;;通常， 含量：1OD260nm=50mg/ml 双链DNA 纯度：OD260nm/OD280nm=1.8 If OD260nm/OD280nm1.8，Contaminated by ? If OD260nm/OD280nm1.8，Contaminated by ? ;;;核酸的大小;迄今测出的最小的基因组;电泳鉴定DNA分子的大小;凝胶电泳分离生物大分子;Agarose gel electrophoresis;迁移率 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 ;DNA分子大小的估计;核酸构型;凝胶电泳的分辨率： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨率在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨率在1～1000bp之间 ;琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。 ;琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：TAE（TBE、TPE），1 x 凝胶的浓度：根据检测的DNA大小，1% DNA样品：1μg，指示剂 电泳条件：大片段低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在302nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA； 荧光强度与DNA的片段大小成正比。;Separation Range Vs. % Agarose;凝胶中DNA分子的可视化;Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose;重组克隆的鉴定：酶切和PCR;聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10％ ）。 可视化：EB、硝酸银 分离范围：1-1000bp;PolyAcrylamide Gels;;脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向移动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。;;;核酸分子杂交鉴定技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 ;杂种核酸分子： 彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用检测特定生物有机体之间的亲源关系。 DNA/DNA或RNA/DNA的能力，揭示核酸片段中某种特定基因的位置。;核酸杂交常用几种膜的性能比较;硝酸纤维素膜 不能滞留小于150bp的DNA片段。 应用1mol/L醋酸铵和0.2mol/L的NaOH缓冲液代替SSC缓冲液可改善对小片段DNA的滞留能力。 RNA变性后能十分容易的结合到膜上。; 尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤： 1. 核酸印迹转移：通常利用毛细作用将核酸样品转移到固体支持膜上。 2. 印迹杂交： 将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的DNA/RNA进行杂交。;Southern Blot DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DN