生长抑制特异蛋白GAS2在慢性粒细胞白血病中异常高表达生物学意义研究.pdf

生长抑制特异蛋白 GAS2 在慢性粒细胞白血病中异常高表达的生物学意义研究 中文摘要 生长抑制特异蛋白 GAS2 在慢性粒细胞白血病中异常高 表达的生物学意义研究 中文摘要 目的：研究生长抑制特异蛋白 GAS2 在慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）细胞中的表达与功能，并初步探讨其作用机制。 方法：（1）使用密度梯度离心获取 CML 患者和健康供体骨髓中的单个核细胞， 使用 CD34 细胞磁珠富集试剂盒纯化 CD34+细胞，并使用 FACS 纯化 lin-CD34+和 lin-CD34+CD38-细胞。Q-RT-PCR 方法检测各类细胞中的 GAS2 转录本表达，免疫荧 光的方法检测 CD34+细胞中 GAS2 蛋白的表达。（2）制备携带靶向 GAS2 的 shRNA 的慢病毒，并侵染 CML 细胞株（K562 和 MEG-01）以及患者的 CD34+细胞，检测 GAS2 沉默与对照细胞的 Calpain 活性、生长和集落生成能力。（3）使用 PCR 的方式 扩增 GAS2DN（GAS2△171-313，GAS2 的显性负性突变体），并克隆至慢病毒载体 中。在 CML 细胞株（K562 和 MEG-01）以及患者的 CD34+细胞中过表达 GAS2DN， 而后检测 GAS2DN 与对照细胞的 Calpain 活性、生长及集落生成能力。（4）使用伊马 替尼（Imatinib mesylate，IM）敏感的 K562 细胞研究 GAS2 沉默和 GAS2DN 表达对 细胞 IM 敏感性的影响。（5）使用 MEG-01 细胞研究 GAS2DN 对细胞裸鼠皮下成瘤 能力的影响。（6）使用免疫共沉淀研究 GAS2 与 Calpain2 在白血病细胞中是否存在相 互结合。在 GAS2DN 过表达的细胞中利用 RNAi 抑制 Calpain2 的表达，以研究 Calpain2 活性的变化在 GAS2DN 影响 CML 细胞生长中的作用。（7）使用 TOPFlash/FOPFlash 报告基因质粒研究 GAS2 沉默及 GAS2DN 对 CML 细胞中β-catenin 转录活性的影响； 也使用免疫印迹等方法研究 GAS2 沉默及 GAS2DN 对 CML 细胞中β-catenin 表达和定 位的影响。（8）建立 GAS2DN 表达及对照 MEG-01 ???胞的基因表达谱数据，并通过 与公共数据库中 CML 相关数据的对比研究靶向 GAS2 影响 CML 细胞生长的分子机 制。（9）使用 Q-RT-PCR 和免疫印迹等方法验证响应 GAS2DN 表达的候选基因，并 使用基因沉默的方式研究候选基因 HNRPDL 在 CML 细胞生长的功能。 结果：GAS2 的 mRNA 表达在 CML 来源的细胞中均较健康供体来源细胞显著增 高；免疫荧光显示 GAS2 蛋白在患者 CD34+细胞中的表达也较正常对照细胞增高。 I 中文摘要 生长抑制特异蛋白 GAS2 在慢性粒细胞白血病中异常高表达的生物学意义研究 使用两条独立的 shRNA 序列能有效抑制 CML 细胞中的 GAS2 表达，并导致 GAS2 蛋白表达的降低并活化细胞中的 Calpain。GAS2 沉默使 CML 细胞株（K562 和 MEG-01）和患者 CD3