Pgc1α在斑马鱼生物钟中作用机制.pdfVIP

中文摘要 生命体的生物钟主要有三部分组成：输入通道、输出通道和核心振荡器。在 单细胞水平，哺乳动物与鱼类生物钟的分子机制基本相同，主要是由多个基因构 成自主调控的转录翻译反馈环路。在这个环路中，CLOCK 和 BMAL 作为环路中 的正向调节因子，形成的异二聚体，进入细胞核结合到负向调节因子 Per 和 Cry 启动子的 E/E’-box 元件来激活其转录。随后，在细胞浆中翻译后，PER 蛋白和 CRY 蛋白结合形成复合体进入细胞核内，与 CLOCK: BMAL 异二聚体相互作用，解除 了 CLOCK: BMAL 异二聚体的转录激活作用，完成一个周期。 过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子家族（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1，Pgc-1），共有三个成员，PGC-1α，PGC-1β以及 PRC。 该家族成员主要参与能量代谢、线粒体增殖、脂类代谢和适应性体温调控等生命 活动。其家族的分子作用模式基本相同，即当配体与核受体结合后，招募其他调 控因子，共同形成复合体驱动或增强靶基因的转录。 Pgc-1α与能量代谢、线粒体增殖密切相关。早期从小鼠灰色脂肪组织提取并发 现 Pgc-1α。经过随后十几年的深入研究，其在能量代谢方面的功能也愈发清晰。 Pgc-1α突变体小鼠模型研究发现突变体在能量代谢方面有明显异常，并且发现其参 与生物钟的调控，因此 PGC-1α可以作为连接生物钟与能量代谢的重要纽带。然而， 斑马鱼 pgc-1α的功能目前尚不清楚。 在本研究中，定量荧光 PCR 结果显示在 LD 和 DD 的条件下，pgc-1α的转录 都呈现出明显的振荡。启动子序列分析发现，在 pgc-1α的启动子区域有一个 D-box 原件和多个 E-like-box 原件。细胞转染实验显示，Bmal1b 和 Clock1a 共转能促进 pgc-1α的表达，而 Cry1aa 抑制了这种激活的作用。qRT-PCR 的技术发现，在 clock1a 突变体中，pgc-1α的表达明显下调。说明生物钟能够直接调控 pgc-1α的表达。另外， 我们利用 Tefa 与 pgc-1α-luc 共转后同样也能提高 pgc-1α表达，并且这种激活性的 作用能被 E4bp4-4 所抑制。这些研究结果说明 pgc-1α受到 E-box 介导的和 D-box 介导的生物钟调节。为了进一步研究 pgc-1α在斑马鱼中的作用，我们利用 TALEN 技术构建了 pgc-1α斑马鱼突变体。定量 PCR 结果发现在 pgc-1α突变体斑马鱼体内， 在持续黑暗条件下和光暗条件下生物钟基因如 bmal1a、bmal1b、bmal2 的表达均 下调，其它钟基因 clock1a、per1b、per2、per3、cry1aa 等表达也出现异常。体外 细胞实验发现，与哺乳动物类似，Pgc-1α同样也能提高 Rorα对 bmal1b 的激活效应， 并且该效应能被 Rev-erbα抑制。行为实验发现，不管是光暗条件还是持续黑暗， pgc-1α突变体的活动量均明显高于野生型，说明 pgc-1α也斑马鱼生物钟调节中起作 用。Pgc-1α在成年斑马鱼的不同组织器官中，对生物钟的影响也各不相同，即存在 组织特异性。另外我们发现突变体的代谢相关基因 pepck、ucp1、pparα、srebf1 等 产生明显的下调。这些结果说明了在斑马鱼体内 pgc-1α与生物钟之间相互影响， 相互调节。 本研究进一步阐明了 pgc-1α在斑马鱼生物钟调控中的作用机制，其作为代谢 与生